Structural and functional analysis of CpBs4C, a Xanthomonas activated resistance protein from Capsicum pubescens

Abstract

Die Dissertation ist bis zum 15. September 2025 gesperrt !

Seit der Entdeckung der bakteriellen Fleckenkrankheit bei Paprika in den 1920er Jahren wurden umfangreiche Forschungsarbeiten durchgeführt, um Mechanismen innerhalb der Pflanze zu identifizieren, die dieser Krankheit entgegenwirken. Das Resistenz (R)-Protein CpBs4C aus Capsicum pubescens wurde erstmals aufgrund seiner transkriptioneller Aktivierung durch das AvrBs4 Protein des bakteriellen Erregers Xanthomonas euvesicatoria identifiziert (Strauß et al. 2012). In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass CpBs4C eine Zelltodreaktion induziert, wenn es in Nicotiana benthamiana überexprimiert wird, das CpBs4C am endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist, und das es in Capsicum annuum CpBs4C Homologe gibt (Wang et al. 2018; Elsaesser 2014). In dieser Arbeit wurden mehrere CpBs4C- Homologe in verschiedenen Pflanzenarten, hauptsächlich innerhalb der Ordnung Solanales, gefunden. Die in Solanum lycopersicum, C. annuum, C. pubescens und N. benthamiana gefundenen Homologe wiesen alle eine ähnliche Tertiärstruktur innerhalb der vorhergesagten Transmembranregion der Proteine auf, während die Nicht-Transmembranregion der Proteine eine sehr unterschiedliche Tertiärstruktur aufwies. Es wurde festgestellt, dass es in N. benthamiana drei Homologe gibt, die in zwei Klassen eingeteilt werden können: Zelltod- induzierende Homologe und nicht Zelltod-induzierende Homologe. Die Strukturanalyse dieser Transmembranregion der Bs4C-Homologen ergab eine starke strukturelle Homologie zu Transmembranregionen von Neurotransmitter-Rezeptoren, die pentamere Liganden- gesteuerte Ionenkanäle sind. Die strukturelle Vorhersage der Bs4C-Transmembranregion in pentamerer Form zeigte eine auffällige Ähnlichkeit mit dem pentameren Ring von Neurotransmitter-Rezeptoren. Ähnlich wie bei Neurotransmitterrezeptoren waren die Bs4C- Homologe aus C. pubescens und N. benthamiana in der Lage, zu Homo- und Heterooligomeren zu assemblieren, und CpBs4C war in der Lage, einen Komplex höherer Ordnung von mindestens 640 kDa zu bilden. Proteomanalysen ergaben, dass der CpBs4C- Komplex eine Bindung an Kalzium-ATPasen aufweist und dass der durch CpBs4C ausgelöste Zelltod durch einen Kalziumkanal-Inhibitor unterdrückt werden konnte. Dies deutet darauf hin, dass die Bewegung von Kalziumionen für die Auslösung des CpBs4C-Zelltods entscheidend ist. CpBs4C ist auch in der Lage, einen Wachstumsstillstand in Arabidopsis thaliana zu induzieren, und über einen neu-entwickelten genetischen Ansatz wurden fünf neue Mutationen in der Exoribonuklease AtXRN4 identifziert, die in der Lage waren, den CpBs4C- induzierten Wachstumsstillstand zu unterdrücken. In der hier vorgestellten Arbeit wurden Wirkmechanismen der CpBs4C-vermittelten Zelltodinduktion identifiziert und Hypothesen zur Funktion von CpBs4C und seinen Ursprung aufgestellt.

Since the identification of bacterial spot disease on pepper in the 1920s (Higgins, 1922), extensive research has been undertaken to identify mechanisms within the plant to counteract this disease. The resistance (R) protein CpBs4C in Capsicum pubescens was first identified through activation by AvrBs4 from Xanthomonas euvesicatoria (Strauß et al., 2012). Previous work discovered that CpBs4C induces cell death when ectopically overexpressed in Nicotiana benthamiana, localises to the endoplasmic reticulum, and there are homologues of CpBs4C in Capsicum annuum (Elsaesser, 2014; Wang et al., 2018). In this work, there were multiple CpBs4C homologues found in myriad different plant species, mainly within the order Solanales. The homologues found in Solanum lycopersicum, C. annuum, C. pubescens, and N. benthamiana all had a similar tertiary structure within the predicted transmembrane region of the proteins. By contrast, the non-transmembrane region of the Bs4C homologues proteins had a very diverse tertiary structure. It was found that there were three homologues in N. benthamiana, and they could be divided into two classes: cell death-inducing homologues and non-cell death-inducing homologues. Further investigation highlighted that the amino acid composition of the transmembrane region of the protein was the differentiating factor between the cell death-inducing homologues and the non-cell death-inducing homologues. Structural analysis of this transmembrane region of the Bs4C homologues identified a strong structural homology to the transmembrane regions of neurotransmitter receptors, which are pentameric ligand-gated ion channels. Structural prediction of the Bs4C transmembrane region in a pentameric fashion showed a striking similarity to the pentameric ring of neurotransmitter receptors. Similarly to neurotransmitter receptors, the Bs4C homologues from both C. pubescens and N. benthamiana were able to homo- and hetero-oligomerize, and CpBs4C was able to form a higher-order complex of at least 640 kDa. Proteomic analysis identified that the CpBs4C complex has a strong indication of binding to calcium-ATPases and that CpBs4C- induced cell death was able to be suppressed by a calcium channel inhibitor, indicating that the movement of calcium ions is vital for the induction of CpBs4C cell death. CpBs4C is also able to induce growth arrest in Arabidopsis thaliana, and the generation of a novel method for a forward genetic screen identified the exoribonuclease AtXRN4 to be required for CpBs4C- induced growth arrest. The work presented herein identifies new mechanisms of action for the cell death induction of CpBs4C and hypothesises the native function of CpBs4C and its true origin.