Inhaltszusammenfassung:
Strukturen und Funktionen von Lipiden werden seit mehr als einem Jahrhundert intensiv untersucht. In dieser Zeit hat sich die Bedeutung von Lipiden jedoch erheblich geändert. Lipide werden heutzutage als "kleine Moleküle, die durch Kondensation von Thioestern auf Carbanionbasis und / oder durch Kondensation von Isopreneinheiten auf Carbokationbasis entstehen" definiert. Die Entwicklung moderner Analysetechniken der letzten Jahrzehnte veranlasste Forscherinnen und Forscher dazu eine umfassende Analytik von Lipiden in biologischen Systemen durchzuführen, welche schließlich als Lipidomik definiert wurde. Die Massenspektrometrie (MS) war seither das wichtigste analytische Instrument und zudem maßgeblich verantwortlich für das exponentielle Wachstum der Lipidomik in den letzten zwanzig Jahren. Im Allgemeinen werden zwei Hauptansätze in der MS verfolgt: Shotgun-Lipidomik (bei welcher der Lipidextrakt ohne Lipidtrennung direkt in das Massenspektrometer injiziert wird) und MS Lipidomik mittels Flüssigchromatographie Kopplung (LC-MS) (bei welcher der Lipidextrakt vor der MS-Detektion chromatographisch aufgetrennt wird).
In dieser Arbeit wurden LC-MS-basierte Lipidomik-Studien entwickelt, um geeignete Bedingungen für die Analyse möglichst vieler Lipidspezies zu ermitteln und dabei eine äußerst zuverlässliche Beschreibung der Lipide zu gewährleisten.
In einer ersten Studie wurden die Extraktionsausbeuten von vier Protokollen für die Analyse von Lipiden in Hela-Zellen verglichen. Der Vergleich basierte auf Parametern wie der Wiederfindung von endogenen Lipiden und internen Standards, sowie der Präzision und der Komplexität der jeweiligen Protokolle. Für den Vergleich wurden zwei klassische Protokolle, welche aus zweiphasigen Systemen (Chloroform-Methanol (MeOH) -H2O, bekannt als Bligh & Dyer, und Methyl-tert-butylether (MTBE) -MeOH-H2O, bekannt als Matyash) bestehen, und zwei neuartige Protokolle, die einphasige Systeme mit Isopropanol (IPA) -H2O (IPA:H2O 75:25 v/v und IPA:H2O 90:10 v/v) bilden, ausgewählt. Nach der Extraktion erfolgte die Analyse der Lipide durch Umkehrphasen-Ultrahochleistungsflüssigchromatographie (UHPLC), gekoppelt mit Quadrupol-Flugzeit-MS (QTOF) und Elektrospray-Ionisation (ESI). Für die MS/MS Datenaufzeichnung bei positiver und negativer Polarität wurde eine datenunabhängige Akquisitionsmethode namens SWATH (engl.: sequential window acquisition of all theoretical fragment-ion spectra) verwendet.
Die Verarbeitung der Daten erfolgte über eine frei verfügbare Software (MS-DIAL). Über die zuvor definierten Parametern konnte gezeigt werden, dass die Extraktion mit IPA:H2O 90:10 v/v vergleichbare Ergebnisse zu dem Protokoll von Matyash liefert und besser als die Extraktion nach Bligh & Dyer funktioniert. Zudem ist die auf IPA-basierende Extraktion einfacher und kann auch mit Kunststoff-Laborbehältern anstelle von Glas durchgeführt werden. Die Verwendung von IPA:H2O 90:10 v/v vereinfacht demnach das Protokoll für die Analyse von Lipiden in Umkehrphasen-LC-MS Lipidomikstudien.
In einer zweiten Studie wurde das optimierte Protokoll (IPA:H2O 90:10 v/v) angewendet, um die Veränderungen des Lipidprofils von Keratinozyten nach Behandlung mit dem Naturstoff Betulin zu untersuchen, der nachweislich wundheilende Eigenschaften aufweist. Daten aus nicht-zielgerichteten UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS Messungen von behandelten Proben sowie von Kontrollproben wurden einer neuartigen, gezielten Datenverarbeitungstrategie zur Identifizierung von Lipiden unterzogen. Diese gezielte Datenverarbeitung basiert auf der Auswahl und Analyse eines spezifischen Satzes von Vorläufer- und Produktionen für jede Lipidklasse und dem entsprechenden Vergleich ihrer Elutionsprofile. Hierbei wurden nicht nur die einzelnen Lipidspezies, sondern auch Ergebnisse für die gesamte Lipidklasse aus unabhängigen Läufen beider Polaritäten berücksichtigt. Das Resultat dieser Analyse war, dass 440 von 611 identifizierten Lipidspezies bei Betulinbehandlung signifikant reguliert wurden. Die Regulation kann als eine Abnahme der Konzentration von Cholesterylestern und Triacylglyceriden bei gleichzeitiger Zunahme von Glycerophospholipiden, Sphingolipiden und Diacylglyceriden nach der Behandlung mit Betulin beschrieben werden.
Schließlich fokussierte sich eine dritte Studie auf eine bestimmte Gruppe von Fettsäuren, die kurzkettige Hydroxyfettsäuren (SCHFA) genannt werden. Durch die Anwesenheit der Hydroxylgruppe entlang der Alkylkette von SCHFA sind diese Analyte chiral. Einige Enantiomere dieser SCHFA werden mit bestimmten Krankheiten in Verbindung gebracht und sind potenzielle Biomarker bei der Diagnose. In dieser Studie wurde die chirale Trennung von SCHFA mittels HPLC an einer Reihe von auf Chinin und Chinidin aufbauenden, chiralen stationären Phasen untersucht. Zudem wurden MS-kompatible Bedingungen für die chirale Trennung aller untersuchten SCHFA analysiert und beschrieben.
Abstract:
Structure and function of lipids have been subject of intense studies for more than one century. However, during this time, the meaning of lipid has changed considerably, and nowadays lipids are defined as “small molecules derived from carbanion-based condensation of thioesters and/or by carbocation-based condensations of isoprene units”. The development of modern analytical techniques in the last decades led researchers to undertake the comprehensive analysis of lipids in biological systems, which has been defined as lipidomics.
Mass spectrometry (MS) has been the most important analytical tool for the exponential growth that lipidomics has achieved in the last twenty years. Two main approaches have been employed in MS: shotgun lipidomics (in which lipid extract is directly infused into the mass spectrometer without lipid separation) and liquid chromatography hyphenated to MS (LC-MS) based lipidomics (in which the lipid extract is first separated chromatographically before MS detection).
In this thesis, LC-MS based lipidomics studies were developed in order to determine proper conditions for analysis of as many lipid species as possible and with the most confident level of description.
In a first study, the performance of four extraction protocols was compared for the analysis of lipids in Hela cells. The comparison was based on performance parameters such as extraction recoveries of endogenous lipids and internal standards, precision, and complexity of the protocols. For the comparison two traditionally employed protocols, based on biphasic systems (chloroform -methanol (MeOH)-H2O, known as Bligh & Dyer, and methyl tert-butyl ether (MTBE)-MeOH-H2O, known as Matyash), and two novel protocols based on monophasic systems of isopropanol (IPA)-H2O (IPA:H2O 75:25 v/v and IPA:H2O 90:10 v/v) were selected. The analysis of lipids after extraction was performed by reversed-phase ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) coupled to quadrupole-time of flight mass spectrometry (QTOF) via electrospray ionization (ESI) using MS/MS by data-independent acquisition in positive and negative polarity mode with sequential window acquisition of all theoretical fragment ion mass spectra (SWATH). Freely available software (MS-DIAL) was employed for the processing of the data. The selected performance parameters showed that extraction with IPA:H2O 90:10 v/v performs similar to the Matyash protocol and better than Bligh & Dyer, with a protocol that is simpler and that can employ plastic labware instead of glass. The use of IPA:H2O 90:10 v/v simplifies the protocol for analysis of lipids in reversed phase LC-MS lipidomics studies.
In a second study, the optimized protocol with IPA:H2O 90:10 v/v was employed to study the changes in the lipid profile of keratinocytes after treatment with the natural compound betulin, which has proven wound healing properties. Data from untargeted UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS measurements of treated and control samples were subjected to a novel targeted data processing strategy for identification of lipids. This targeted data processing is based on the selection and analysis of a specific set of precursor and product ions for each lipid class and the corresponding comparison of their elution profiles not only for the lipid species but also for the whole lipid class in independent runs measured with opposite polarities. As a result of this analysis 440 out of 611 identified lipid species showed to be significantly regulated upon betulin treatment. Regulation can be described as a decrease in the concentration of cholesteryl esters and triacylglycerides and increase of glycerophospholipids, sphingolipids and diacylglycerides after the treatment with betulin.
Finally, a third study was focused on a particular group of fatty acids, which are called short chain hydroxy fatty acids (SCHFA). The presence of the hydroxyl group along the alkyl chain of SCHFA made them chiral. Some enantiomers of these SCHFA are linked to particular diseases and are potential biomarkers for diagnosis. In this study SCHFA were studied for their chiral separation by HPLC on a set of quinine- and quinidine-derived chiral stationary phases. MS compatible conditions for chiral separation of all studied SCHFA are analyzed and reported.
Chiral Chromatography
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