Charakterisierung und Funktionalisierung von β-Catenin-spezifischen Einzeldomänen-Antikörperfragmenten

Abstract

β-Catenin ist das Schlüsselprotein des Wnt/β-Catenin Signalwegs und ist durch seine Funktion als Adaptorprotein zwischen E-Cadherin und α-Catenin an der Verknüpfung der Adhärenzverbindungen mit dem Zytoskelett beteiligt. Diese Verknüpfung zwischen Zytoskelett und Adhärensverbindungen spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-polarisierung und der Zell-Zell-Interaktion. Des Weiteren ist β-Catenin über den Wnt-Signalweg an entwicklungsbiologischen und homöostatischen Prozessen beteiligt. Intrazelluläre β-Catenin Level werden durch einen Multi-Protein-Komplex, bekannt als ‚Destruction-Komplex‘ reguliert. Durch Aktivierung des kanonischen (β-Catenin abhängig) Wnt-Signalwegs, über die Bindung von Wnt mit den extrazellulären Domänen der Rezeptorproteine (LRP6 und Frizzeled) an der Zellmembran, kommt es zur Inaktivierung des Destruction-Komplexes und zur Stabilisierung des zytoplasmatischen β-Catenin. Dieses translociert in den Zellkern und aktiviert über die Interaktion mit Proteinen der TCF/LEF-Familie die Expression Wnt-assozierter Gene (WRE). Proteine, die am Destruction-Komplex beteiligt sind, kontrollieren die Phosphorylierung einer Regulationsdomäne und die nachfolgende Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von β-Catenin. Aufgrund dessen ist die anomale Stabilisierung durch Mutationen von β-Catenin oder Schlüsselregulatoren des ‚Destruction-Komplexes‘ assoziiert mit einer Vielzahl von Erkrankungen. In 80 % aller kollorektalen Karzinome, in einigen Fällen von Brustkrebs, sowie in neurodegenerativen Erkrankungen, wie der Alzheimer Erkrankung, spielt die Deregulation von β-Catenin eine wichtige Rolle. Dies macht β-Catenin zu einem wichtigen Ziel für die Untersuchung der Wnt gesteuerten Regulation und der intrazellulären Dynamik, sowie der Forschung und Entwicklung von Inhibitoren, die der kanzerogenen Wirkung entgegenwirken. Herkömmliche Methoden der Beobachtung von intrazellulären Abläufen, wie Fusionsproteine oder Antikörper, haben den enormen Nachteil, dass sie häufig die Funktion des Antigens beeinträchtigen und natürliche Abläufe des Wnt-Signalwegs nicht detailliert abbilden können. Eine Alternative schaffen hier neue Entwicklungen in der rekombinanten Antikörpertechnologie. Im Besonderen zu erwähnen, die Verwendung kleiner, flexibler und intrazellulär exprimierbarer Antikörperfragmente. Diese werden aus den variablen Domänen von nur schweren Ketten enthaltenden Antikörpern, welche in Camelidae vorkommen, gewonnen. In dieser Arbeit wird die Selektion, Charakterisierung und Spezialisierung von β-Catenin-spezifischen Einzeldomänen-Antikörper-Fragmenten (‚single domain antibodies/sdAbs) oder Nanobodies (Nbs) für ein weites Feld von Anwendungen demonstriert. Die Nbs werden über biochemische Verfahren charakterisiert und der Einsatz für Immunpräzipitations-Assays zur Analyse des Interaktoms von β-Catenin, sowie einem immundiagnostischen Verfahren demonstriert. Dabei konnte ein Nb identifiziert werden, welcher ein lineares 12 AS-Epitop erkennt und als Affinitätstag verwendet werden kann. Des Weiteren konnte die intrazelluläre Expression und Adressierung des Antigens von drei Nbs in zellbiologischen Verfahren unter Beweis gestellt werden. Dabei wurde in Transkriptionsanalyse-Assays ermittelt, dass zwei intrazelluläre Nbs die Fähigkeit zur Inhibition β-Catenin-assozierter Transkription besitzen. Zuletzt konnte durch die Charakterisierung ein Nb selektiert werden, der alle Eigenschaften besitzt die β-Catenin-Dynamik darstellen zu können. Dazu gehört hohe Affinität und Spezifität zum Antigen, intrazelluläre Löslichkeit und Expression in Verbindung mit einem fluoreszierenden Fusionstag, geringe Toxizität und keine Inhibition oder Aktivierung der β-Catenin-gesteuerten Transkription. Diese Arbeit zeigt die vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten der Nb-Technologie auch im Bereich komplexer Signaltransduktionen, wie des Wnt/β-Catenin-Signalwegs.