Chimäre Adenylatcyclasen aus Mycobacterium und Mammalia: Versuche zur Solubilisation und Regulation

Abstract

Adenylatcyclasen (ACn) katalysieren die Reaktion von Adenosintriphosphat (ATP) zu zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und Pyrophosphat. Die hier verwendeten ACn (Rv3645, Rv1625c, verschiedene Mammalia-ACn) entstammen der Klasse III, die sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten zu finden sind. Für membranständige ACn liegen eindeutige Hinweise vor, dass der Membrananker möglicherweise auch eine Rezeptorfunktion besitzt. Strukturdaten über diesen Membrananker könnten für eine weitere Analyse dienlich sein. Bislang konnte aber nur bei einem Bruchteil von Membranproteinen die Struktur entschlüsselt werden. Das Hauptproblem bei der Strukturaufklärung von Membranproteinen ist nach der Überexpression der Proteine deren Solubilisation in einem aktiven und regulierbaren Zustand. Es gibt verschiedene Methoden der Solubilisation, von denen einige an den chimären Konstrukten Tsr-HAMPTsr-Rv3645 und Tsr-HAMP3645-Rv3645 ausprobiert wurden. Die Chimären wurden gegenüber dem Holoenzym der AC bevorzugt, da diese Konstrukte nur zwei Transmembranspannen (TMs) als Membrananker enthielten und die Funktion des Tsr-Rezeptors durch Regulation mit Serin überprüfbar war. Um die Solubilisation zu unterstützen, wurden unterschiedliche Transmembranmutanten der Chimären gebildet, Fusionsproteine wie das T4 Lysozym oder die E. coli Proteine YaiN und YbeL eingesetzt und die Expression in einem zellfreien Proteinbiosystem getestet. Bis auf drei Ausnahmen (Tsr-HAMPTsr-Rv3645-[A16K], -[A16K/V203E], -[A192S/L196Q/F208S]) zeigten die Transmembranmutanten nur noch geringe Aktivität und keine Regulation mehr durch Serin. Bei den Fusionskonstrukten ergab das aktivste Konstrukt mit YbeL am N-Terminus von Tsr-HAMPTsr-Rv3645 nach Solubilisation in 1% Brij58 aktives Protein mit reduzierter Regulation (22% Hemmung) durch Serin. Im zellfreien Expressionssystem konnte Protein im Überstand der Reaktion nach Einsatz verschiedener Detergenzien (Brij35, Brij58, Brij78, Brij98, Digitonin, C12E8, DDM, MNG-3) nachgewiesen werden. Die Basalaktivitäten der gelösten Proteine waren allerdings äußerst gering, die Regulation durch Serin war verloren. Zusätzlich wurde die Regulation von chimären Proteinen aus dem bakteriellen quorum sensing Rezeptor CqsS mit Mammalia-ACn untersucht, da hier der 6-TM-Anker der AC durch einen 6-TM-Rezeptor ausgetauscht werden konnte. Trotz aller Bemühungen blieben die Basalaktivitäten der CqsS-AC-Chimären sehr gering (zwischen 30-100 pmol cAMP∙mg-1∙min-1). Nur in einzelnen Konstrukten konnte eine schwache Regulation durch den Liganden CAI-1 und teilweise Stimulation durch eine konstitutiv aktive stimulierende α-Untereinheit des G-Proteins (Gsα*) festgestellt werden. Auf Grund von Expressionsproblemen der Mammalia-ACn im E. coli-Expressionsystem wurde die mykobakterielle AC Rv1625c durch Mutation in ein Modellsystem für Mammalia-ACn umgewandelt. Zunächst entstand durch Mutation der katalytischen Aminosäuren aus Rv1625c ein Heterodimer (Rv1625c-C1 bzw. –C2) nach Vorbild einer Mammalia-AC. Durch weitere Mutationen wurden Rv1625c-C1 und –C2 sowohl aus struktureller Sicht als auch in Bezug auf Gsα-bindende Aminosäuren an Mammalia-ACn angepasst. Ziel war die Aktivierung des Rv1625c-Heterodimers durch Gsα*. Je nach Kombination der getesteten Mutationen war sowohl eine Hemmung als auch eine Stimulation durch Gsα* feststellbar, wobei die höchste Stimulation 33% betrug.