Identification and Characterization of the Novel Fungal MAMP SsE1 and its Receptor-Like Protein (RLP30)-based Perception System in Arabidopsis

Abstract

Effective plant defense strategies rely on the perception of non-self determinants, so-called microbe-associated molecular patterns (MAMPs), by transmembrane pattern recognition receptors (PRRs) leading to MAMP-triggered immunity (MTI). Plant resistance against necrotrophic pathogens with a broad host-range is complex and yet not well understood. Particularly, it is unclear if resistance to necrotrophs involves MTI. In this thesis, a novel proteinaceous elicitor called SsE1 was partially purified from the necrotrophic fungal pathogen Sclerotinia sclerotiorum that induces typical MTI responses in the model plant Arabidopsis thaliana. Analysis of natural genetic variation between different Arabidopsis accessios revealed five ecotypes (Mt-0, Lov-1, Lov-5, Br-0 and Sq-1) that are fully insensitive to SsE1. Using a F2 segregating population from crosses between Col-0 and the SsE1-insensitive ecotype Lov-1 the locus determining SsE1 sensitivity was mapped to RECEPTOR-LIKE PROTEIN 30 (RLP30). Further reverse genetic screens revealed that SsE1-triggered immune responses depend on two receptor-like kinases, BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1 (BAK1) and SUPPRESSOR OF BIR1 1/EVERSHED (SOBIR1/EVR). Knock-out mutant lines for these three genes are more susceptible to S. sclerotiorum and the taxonomically-related fungus Botrytis cinerea. Whereas SOBIR1 physically interacts with RLP30 in a ligand-independent manner and is required for RLP30 localization to the plasmamembrane, complex formation of BAK1 and RLP30 could not yet be demonstrated. However, the cytoplasmic tail of RLP30 can be phosphorylated by the kinase domain of BAK1 in an in vitro kinase assay. Furthermore, transient co-expression of RLP30 and SOBIR1 confers SsE1 sensitivity to naturally SsE1-insensitive N. benthaminana plants. As SOBIR1 is also involved in the MAMP signaling pathway triggered by the novel elicitor EMAX from Xanthomonas species and which is mediated by another RLP-PRR, REMAX/RLP1, it can be assumed that SOBIR1 is a novel co-receptor for PRRs of the RLP-type. The identification of SsE1 and RLP30 as a potential MAMP-PRR pair demonstrates the relevance of plant MTI in the resistance to necrotrophic fungi. Hence, the application of co-delivered RLP receptor complex components, such as RLP30 and SOBIR1, could serve as novel genetic tool for the generation of fungus-resistant crops.

Effektive Pflanzenabwehrstrategien beruhen auf der Erkennung von “Nicht-Selbst”-Determinanten, den sogenannten Mikroben-assoziierten Molekularen Mustern (microbe-associated molecular patterns, MAMPs), durch transmembrane Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors, PRRs) und entsprechende MAMP-ausgelöste Immunität (MAMP-triggered immunity, MTI). Die pflanzliche Resistenz gegenüber nekrotrophen Pathogenen mit einem breiten Wirtsspektrum ist komplex und bisher noch nicht gut verstanden. Im Besonderen ist unklar, ob Mechanismen der MIT für die Resistenz gegenüber Nekrotrophen benötigt wird. In dieser Arbeit wurde eine neue proteinöse Elizitoraktivität aus dem nekrotrophen pilzlichen Pathogen Sclerotinia sclerotiorum partiell aufgereinigt, die SsE1 (Sclerotinia sclerotiorum Elicitor 1) genannt wurde und die typische pflanzliche Abwehrreaktionen in der Modelpflanze Arabidopsis thaliana auslöst. Analysen der genetischen Variation zwischen verschiedenen Arabidopsis Ökotypen ergaben fünf Ökotypen (Mt-0, Lov-1, Lov-5, Br-0 und Sq-1) mit einer vollständigen Insensitivität gegenüber SsE1. Die segregierende F2-Population der Kreuzung zwischen Col-0 und dem SsE1-insensitiven Ökotypen Lov-1 wurde für die klassische MAP-basierte Klonierung des für die SsE1-Erkennung nötigen Lokus verwendet und ergab das Rezeptor-ähnliche Protein RLP30. Zusätzlich wurden in einem reversen genetischen Ansatz die beiden Rezeptorkinasen BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1 (BAK1) und SUPPRESSOR OF BIR1 1/EVERSHED (SOBIR1/EVR) als weitere Komponenten der SsE1-Erkennungsmachinerie identifiziert. Knock-out Mutanten aller drei Gene sind anfälliger gegenüber einer Infektion mit S. sclerotiorum sowie des taxonomisch verwandten Pilzes Botrytis cinerea. Während SOBIR1 mit RLP30 liganden-unabhängig interagieren kann und für die Plasmamembran-Lokalisation von RLP30 nötig ist, konnte eine RLP30/BAK1-Interaktion bisher nicht nachgewiesen werden. Allerdings kann der cytoplasmatische Teil von RLP30 von der BAK1-Kinasedomäne in vitro phosphoryliert werden. Transiente Co-Expression von RLP30 und SOBIR1 führte in natürlicherweise SsE1-insensitiven N. benthamiana-Pflanzen zur SsE1-Erkennung. Da SOBIR1 auch für die Signalweiterleitung nach Erkennung eines weiteren neuen MAMPs, EMAX (enigmatic MAMP from Xanthomonas), durch das Rezeptorprotein RLP1/REMAX nötig ist (Jehle et al., 2013), kann man SOBIR1 als einen neuen Ko-Rezeptor für RLP-PRRs betrachten. Die Identifikation von SsE1 und RLP30 als neuem MAMP-PRR-Paar veranschaulicht die Wichtigkeit von pflanzlicher MTI in der Resistenzantwort gegenüber nekrotrophen Pilzen. Deshalb könnte eine gleichzeitige Applikation von mehreren Rezeptorkomplex-Komponenten, wie z.B. RLP30 und SOBIR1, ein neues genetisches Mittel zur Herstellung pilzresistenter Kulturpflanzen darstellen.