Charakterisierung onkologischer Medikamentenkandidaten durch Analyse der zellulären Signalübertragung

Abstract

Das Potential neuartiger Antitumorsubstanzen kann nur durch detaillierte Analyse ihrer Wirkmechanismen voll ausgeschöpft werden. Umfassende Aktivitätsbestimmungen zellulärer Signalwegsproteine bereits in frühen Phasen der Medikamentenentwicklung eignen sich hierfür besonders. Durch Verbindung des dreidimensionalen Tumorsphäroid-Modells mit einer Mikroarray-basierten Proteinanalytik wurden in dieser Arbeit komplexe Signaltransduktionsanalysen auf Material ermöglicht, welches die Situation in humanen Tumormetastasen widerspiegelt. Dabei wurde die Wirkung von Medikamentenkandidaten aus frühen klinischen Entwicklungsphasen eingehend auf humanen Kolontumorsphäroiden analysiert.

Ein Inhibitor des mitotischen Kinesins Eg5 zeigte neben dem für diese Substanzklasse typischen mitotischen Arrest der Zellen weitere relevante Effekte. Translationsinduktion durch aktivierte mTOR- und MAPK-Signalwege sowie Induktion von Ki-67 und Phosphorylierung von Rb deuteten auf eine Überführung ruhender Zellen in den aktiven Zellzyklus hin. Der Eg5-Inhibitor scheint somit den proliferativen Zustand von Zellen zu adressieren: Während ruhende Zellen (z.B. im Sphäroidinneren) in den aktiven Zellzyklus überführt und zur Proliferation angeregt werden, werden proliferierende Zellen (z.B. in der Sphäroidperipherie) mitotisch arretiert. Dies könnte einen neuen Ansatz für die Therapie von Tumorstammzellen darstellen, welche in den aktiven Zellzyklus überführt und in dessen Verlauf abgetötet werden könnten.

Auch bei der Charakterisierung zweier Histon-Deacetylase-Inhibitoren (HDACi) wurde durch Reduktion des SOX-2-Niveaus eine Wirksamkeit gegen Tumorstammzellen impliziert. Des Weiteren kam es in Tumorzellen zu einer starken Apoptoseinduktion sowie durch Hemmung von HDAC6 und HDAC1 zur Inhibition von HSP90. Bei der untersuchten Hydroxamsäure konnte zudem, wahrscheinlich bedingt durch eine verstärkte Acetylierung, eine Induktion von STAT3 und somit eine Beeinflussung des JAK-STAT-Signalwegs nachgewiesen werden. Das Benzamid-Analogon zeigte in hoher Dosierung HDACi-typische Effekte, wohingegen in geringer Dosierung ein Mitosearrest detektiert wurde. Dieser könnte infolge der inhibierten HDAC1-3-abhängigen Deacetylierung spindelassoziierter Proteine durch Aktivierung des Spindel-Kontrollpunkts verursacht werden und stellt eine bisher unbekannte Wirkung von HDACi dar.

Für drei onkologische Medikamentenkandidaten konnten mit Protein-Mikroarrays detaillierte Wirkprofile in humanen Tumorsphäroiden erstellt werden. Während bekannte Mechanismen bestätigt wurden, konnte eine Vielzahl neuer Wirkungen aufgedeckt werden, wodurch sich für die Tumortherapie neue Möglichkeiten ergeben.

To exploit the full potential of novel anticancer drugs, detailed knowledge of their mode of action is required. Comprehensive signal transduction analysis is capable of providing this information early in drug development. By combining microarray-based protein analysis with three-dimensional tumor spheroids, a system that enables signal transduction analysis on tumor-like material was established. This tumor model allows detailed mode of action analysis and was employed for studying the mode of action of novel anticancer drug candidates.

Inhibition of the mitotic kinesin Eg5 by a novel compound lead, as expected, to mitotically arrested cells. Induction of translation was seen, as indicated by active mTOR- and MAPK-signaling pathways, as well as through the increase of Ki-67, and an increase in Rb phosphorylation. These observations imply the transition of quiescent cells to the active cell cycle. Therefore, the Eg5 inhibitor is likely to address the proliferative state of the cells: While quiescent cells (e.g. cells in the spheroid center) are transferred to the active cell cycle and into proliferation, proliferating cells (e.g. cells in the spheroid periphery) are arrested mitotically. This observation could form the basis of a novel approach for the treatment of tumor stem cells, as they could be driven to enter the active cell cycle before subsequent killing.

The characterization of two novel histone deacetylase inhibitors (HDACi) also pointed to efficacy towards cancer stem cells. These compounds lead to reduction of SOX-2 levels, distinct induction of apoptosis, inhibition of HDAC6 and HDAC1 and loss of HSP90 function. One of the examined compounds, a hydroxamic acid, showed impact on JAK-STAT-signaling, as detected by induced STAT3 levels, which are likely to be associated with induced acetylation. High dosage of the second compound, a benzamide analogue, exhibited typical HDACi-effects whereas low dosage resulted in mitotically arrested cells. This might be due to an inhibition of HDAC1-3-dependent deacetylation of spindle proteins, causing activation of the spindle assembly checkpoint. This observation reveals a novel effect of HDAC inhibition.

By applying protein microarrays in combination with tumor spheroids, detailed mode of action analyses were conducted for three novel anticancer drug candidates. Known mechanisms were confirmed and a variety of new effects, that give novel opportunities for tumor therapy, were found.