MbtH and Adenylate-Forming Enzymes in the Biosynthesis of Aminocoumarin Antibiotics and Vancomycin

Abstract

Streptomycetes possess biosynthetic gene clusters that allow them to produce a multiplicity of secondary metabolites. These include pharmaceutically relevant compounds like prenylated phenazines as well as aminocoumarin- and glycopeptide antibiotics. For specific alterations in the structure of these substances an exact knowledge of the steps of their biosynthesis is of central importance. In this work, enzymes of the biosynthesis of different compounds were biochemically characterized. This allows structural modifications and creation of new derivatives in the future plus an enhancement of the production yield.

The first part of this work describes the identification and characterization of the prenyltransferase PpzP from Streptomyces anulatus which transfers a prenyl moiety to a phenazine. PpzP is encoded in a cluster with genes for the biosynthesis of phenazine-1-carboxylic acid (PCA) and the prenyl donor dimethylallyldiphosphate (DMAPP). Cloning and expression of the gene and purification of PpzP resulted in a 37 kDa soluble protein. Activity assays and mass spectrometric analyses confirmed the formation of a C-C bond between the C-1 atom of the isoprenoid substrate and the C-9 atom of the aromatic compound. In contrast to many other prenyltransferases the reaction of PpzP is independent of magnesium or other divalent cations. The Km values for the substrates were determined as 116 µM for DMAPP and 35 µM for PCA with a turnover number kcat of 0,435 s-1. The sequence of PpzP shows clear homology to the family of aromatic ABBA prenyltransferases. Therefore PpzP broadens the spectrum of accepted substrates of this family, previously limited to phenolic compounds, to phenazine derivatives.

In the second part the adenylate-forming enzymes of the aminocoumarin biosynthetic gene cluster of rubradirin were identified and characterized. These enzymes catalyze the activation of L-tyrosine as a precursor of the aminocoumarin moiety, as well as the formation of an amide bond between an acyl moiety and this aminocoumarin ring. Interestingly, the cluster of rubradirin contains three genes coding for putative enzymes that may catalyze this reaction. Therefore, all three genes were cloned and expressed and the proteins purified for biochemical studies. The 55 kDa Orf4 was shown to be an active amide synthetase in vitro. However, the 56 kDa RubF6 was inactive despite its 88 % sequence identity to Orf4, but site directed mutagenesis of the ATP-binding loop converted it into an active enzyme. The third 138 kDa protein, RubC1, was shown to be a unique bifunctional enzyme. It is comprised of an amide synthetase domain as well as a domain for L-tyrosine adenylation with subsequent binding on a peptidyl carrier domain. This natural hybrid enzyme is singular among known proteins and presents a particularly effective machinery for aminocoumarin antibiotic biosynthesis.

The third part is concerned with MbtH-like proteins. Their effect on enzymes that catalyze the adenylation of amino acids was characterized biochemically. The MbtH-like proteins, comprised of approximately 70 amino acids, are encoded in gene clusters of non-ribosomal peptide synthetases. Their function in the biosynthesis was unknown at the beginning of this study but has recently been elucidated, with this study contributing to it. Investigation of the role of MbtH-like proteins in the biosynthesis of the aminocoumarin antibiotics novobiocin, clorobiocin and simocyclinone D8 as well as the glycopeptide antibiotic vancomycin proved that they influence the activity of tyrosine-adenylating enzymes. It could be shown that the tyrosine-activating enzymes CloH, SimH and Pcza361.18, involved in the biosynthesis of clorobiocin, simocyclinone D8 and vancomycin, respectively, require the presence of MbtH-like proteins in a molar ratio of 1:1. They form a heterotetramer consisting of two adenylating enzymes and two MbtH-like proteins. In contrast, NovH from novobiocin biosynthesis showed activity even in the absence of MbtH-like proteins, but could be stimulated by them. NovH and CloH share 83 % identity in their amino acid sequence, yet show a striking difference in their requirement for MbtH-like proteins. To further this phenomenon, 3D structure models were created and compared. This showed that one amino acid differs in the otherwise complete conserved active center. A site-directed mutagenesis of this amino acid in CloH (L383M) indeed resulted in an MbtH-independent mutant. All investigated tyrosine-adenylating enzymes exhibited remarkable promiscuity for MbtH-like proteins from different pathways and organisms. Additionally, the MbtH-like protein YbdZ from E. coli was found to co-purify with the heterologously expressed tyrosine-adenylating enzymes, leading to incorrect biochemical results. Therefore, a knock-out strain was created in which the corresponding gene was deleted. This was of central importance for a reliable biochemical characterization of the tyrosine-adenylating enzymes.

Streptomyceten besitzen Biosynthese-Gencluster, die sie befähigen eine Vielzahl von sekundären Metaboliten zu bilden. Darunter befinden sich auch pharmazeutisch relevante Verbindungen wie prenylierte Phenazine sowie Aminocoumarin- und Glycopeptid-Antibiotika. Für die gezielte Veränderung dieser Substanzen ist ein genaues Verständnis der Abläufe ihrer Biosynthese unerlässlich. In dieser Arbeit wurden Enzyme der Biosynthese von verschiedenen Verbindungen biochemisch charakterisiert. Dies erlaubt in Zukunft Modifikationen der chemischen Strukturen und die Herstellung neuer Derivate sowie eine Verbesserung der Produktausbeute.

Im ersten Teil der Arbeit wurde die Prenyltransferase PpzP aus Streptomyces anulatus identifiziert und charakterisiert, welche eine Prenyleinheit auf ein Phenazin überträgt. ppzP liegt in einem Cluster mit den Genen für die Biosynthese von Phenazin-1-Carbonsäure (PCA) und dem Prenyldonor Dimethylallyldiphosphat (DMAPP). Klonierung und Expression des Gens und Reinigung von PpzP führte zu einem 37 kDa großen, löslichen Protein. Aktivitätstest und massenspektrometrische Untersuchungen bestätigten die Bildung einer C-C Bindung zwischen dem C1-Atom des isoprenoiden Substrats und dem C9-Atom des Aromaten. Dabei ist die Reaktion von PpzP im Gegensatz zu vielen anderen Prenyltransferasen unabhängig von Magnesium oder anderen zweiwertigen Kationen. Die Km-Werte für die Substrate wurden mit 116 µM für DMAPP und 35 µM für PCA bestimmt mit einer Wechselzahl kcat von 0,435 s-1. Die Sequenz von PpzP zeigt deutliche Homologie zu der Familie von aromatischen ABBA-Prenyltransferasen. Dadurch erweitert PpzP den Bereich der von dieser Familie akzeptierten Substrate, der bisher nur phenolische Verbindungen enthielt, um Phenazin-Derivate.

Der zweite Teil beschreibt die Identifizierung und Charakterisierung der adenylat-bildenden Enzyme aus dem Gencluster des Aminocoumarin-Antibiotikums Rubradirin. Diese Enzyme werden für die Aktivierung von L-Tyrosin als Vorstufe des Aminocoumarin-Rings benötigt, weiterhin für die Bildung einer Amidbindung zwischen einer Acyl-Einheit und jenem Aminocoumarin Ring. Überraschenderweise enthält das Biosynthese-Gencluster von Rubradirin drei putative Gene, die diese Reaktion katalysieren könnten. Daher wurden alle drei Gene kloniert und exprimiert und die Proteine gereinigt und biochemisch charakterisiert. Für das 55 kDa große Protein Orf4 konnte eine in vitro Amidsynthetaseaktivität nachgewiesen werden. Das 56 kDa große Protein RubF6 hingegen war trotz einer 88 %igen Sequenzidentität zu Orf4 inaktiv, konnte jedoch durch zielgerichtete Mutagenese der ATP-bindenden Schleife in ein aktives Enzym umgewandelt werden. Das dritte Protein, RubC1 mit 138 kDa, wurde als bifunktionales Enzym identifiziert. Es umfasst sowohl eine Amidsynthetase-Domäne als auch eine Domäne für die Adenylierung von L-Tyrosin und anschließende Bindung an eine Peptidyl-Carrier-Domäne. Solch eine hybride Zusammensetzung dieser Domänen ist bislang einzigartig und zeigt einen sehr effizienten Mechanismus für die Biosynthese von Aminocoumarin Antibiotika auf.

Der dritte Teil befasst sich mit MbtH-ähnlichen Proteinen. Dabei wurde ihre Wirkung auf Enzyme, welche die Adenylierung von Aminosäuren katalysieren, biochemisch untersucht. Die rund 70 Aminosäuren umfassenden MbtH-ähnlichen Proteine sind in Biosynthese-Genclustern codiert, die Peptide über nicht-ribosomale Peptidsynthetasen bilden. Für die Untersuchung der Funktion von MbtH-ähnlichen Proteinen, die zu Beginn dieser Studie unbekannt war, wurden verschiedene Antibiotika-Biosynthese-Gencluster hinzugezogen. Im speziellen waren dies die Cluster der Aminocoumarin-Antibiotika Novobiocin, Clorobiocin und Simocyclinon D8 sowie des Glycopeptid-Antibiotikums Vancomycin. Dabei zeigte sich, dass MbtH-ähnliche Proteine die Aktivität der Tyrosin-adenylierenden Enzyme beeinflussen. Die Tyrosin-aktivierenden Enzyme der Clorobiocin, Simocyclinon D8 und Vancomycin Biosynthese, CLoH, SimH und Pcza361.18 benötigen ein MbtH-ähnliches Protein in einem molaren Verhältnis von 1:1 für optimale Aktivität. Dabei formen die Proteine ein Heterotetramer aus je zwei adenylierenden Enzymen und je zwei MbtH-ähnlichen Proteinen. Im Gegensatz dazu benötigt NovH aus der Novobiocin-Biosynthese kein MbtH-ähnliches Protein, wird jedoch durch dessen Zugabe in seiner Aktivität gesteigert. Um den Unterschied in der MbtH-Abhängigkeit zwischen den zu 83 % identischen Proteinen NovH und CloH zu untersuchen, wurden 3D-Strukturmodelle erstellt und verglichen. Dabei war nur eine Aminosäure im ansonsten identischen aktiven Zentrum verschieden. Eine zielgerichtete Mutagenese dieser Aminosäure in CloH (L383M) führte zu einer MbtH-Unabhängigkeit dieser Mutante. Die Abhängigkeit der Tyrosin-aktivierenden Enzyme beschränkte sich nicht auf ein spezifisches MbtH Protein, sondern ließ sich auch mit Homologen aus andern Clustern stimulieren. Insbesondere das MbtH-ähnliche Protein YbdZ aus E. coli führte durch die Co-Reinigung der heterolog exprimierten Tyrosin-adenylierenden Enzyme zu einer Verfälschung der Aktivitätsmessungen. Daher wurde ein knock-out Stamm erstellt, in dem das entsprechende Gen deletiert wurde. Dies war von zentraler Wichtigkeit für eine zuverlässige Charakterisierung der Tyrosin-aktivierenden Enzyme.