Veränderungen der Wirtszellgenexpression in Keratinozyten durch karzinogene humanpathogene Papillomaviren

Abstract

Persistierende Infektionen mit den high risk HPV-Typen 16 und 18 weisen das höchste Risiko für die Entstehung eines Zervixkarzinoms auf. Da jedoch mehr als die Hälfte der persistenten Infektionen nicht entarten, stellt sich die Frage nach weiteren Kofaktoren. Zahlreiche Publikationen belegen, dass sich mit einer Entartung von HPV-positiven Läsionen häufig der physikalische Status der viralen DNA verändert. Insbesondere findet man in HPV18-positiven Zervixkarzinomen ausschliesslich in das Wirtsgenom integrierte Virus-DNA, welche häufig Deletionen der viralen Gene E1, E2, E4, E5 und L2 aufweist. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, welchen Einfluss die Integration der HPV18-DNA auf die virale und zelluläre Genexpression besitzt. Hierzu wurden mehrere humane Keratinozyten-Zelllinien erzeugt, welche extrachromosomale HPV18wt- oder integrierte HPV18 E1mt-Genome enthalten. Überraschenderweise wurde die Expression von viralen Transkripten für die E6 und E7 Onkoproteine durch das Integrationsereignis verringert. Globale Transkriptionsanalysen mittels Affymetrix U133A Microarrays zeigten, dass HPV18 die Genexpression von humanen Keratinozyten stark beeinflusst. Es waren 327 zelluläre Gene durch HPV18wt und 418 Gene durch HPV18E1mt in ihrer Expression mehr als 2-fach verändert. Ca. 80 dieser Gene stellen Zielgene des RB/E2F-Signaltransduktionswegs dar, was vermutlich auf der Inaktivierung des RB-Proteins durch das HPV18 E7 Onkoprotein beruht. Weiterhin war die Expression von p53- und NFkB -regulierten Genen verändert. Beim Vergleich von HPV18wt-Zellen mit HPV18E1mt-Zellen konnte nur die differentielle Ex-pression eines Gens ( ITM2A) validiert werden. Daher wurden zusätzlich Zelllinien erzeugt, welche HPV18-Genome ohne E2, E4 und E5 Gene und einem partiellen E1 Gen besitzen. In diesen Zellen war die Expression von DLG7, EIF5A, GRIP2, LTBP1, SMAD3, und TERT ge-genüber HPV18wt und HPV18E1mt Zellen verändert. Dies könnte bedeuten, dass v.a. der Verlust von E1, E2, E4 oder E5 weitere Veränderungen in HPV18-infizierten Zellen bewirkt, welche die Progression begünstigen könnten. Die in dieser Arbeit identifizierten Gene könn-ten mögliche Biomarker zur Abschätzung des Progressionsrisikos von high risk HPV-infizierten Individuen darstellen.

Infections with human papillomavirus (HPV) 18 have been linked to the development of cervical cancer. HPV18 genomes persist extrachromosomally in precancerous lesions but are always integrated in cervical cancers. Therefore, viral integration might be an important step in the progression of HPV-induced lesions. To address whether HPV18 integration influences viral and/or cellular gene expression, we generated a replication-deficient HPV18 genome by introducing a stop codon into the E1 replication gene (HPV18E1CTTL). Wild type and mutant HPV18 DNA was transfected into normal human keratinocytes (NHK) from four different donors. In all HPV18WT-transfected lines DNA was found to be extrachromosomal at 30-300 virus copies/cell. In contrast, all HPV18 mutant lines contained integrated genomes at 1-30 virus copies/cell. E6/E7 oncogene transcript levels per cell were increased in wt and mt cell lines, but the E6/E7 levels were more increased in wt cell lines. To examine changes in host cell gene expression, RNA from NHK, HPV18wt and HPV18mt cell lines were further analysed by genechip arrays. Comparison analysis of HPV18wt with NHK cells revealed that only 327of 18000 genes are regulated more than 2-fold. 56 of these are known or potential targets of E2F transcription factors and the up regulation is therefore most likely due to the viral E7 protein. Surprisingly, comparison analysis of HPV18wt with HPV18mt cell lines did not reveal any consistent changes. These data suggest that neither the loss of E1 expression nor viral full length integration induces dramatic changes in normal keratinocytes.