Generierung von Knock-In-Mausmodellen für die humanen Mutationen CNGB3R403Q und CNGB3S435F in der beta-Untereinheit des zapfenspezifischen, durch zyklische Nukleotide gesteuerten Ionenkanals

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Generierung von Knock-In-Mausmodellen für die humanen Mutationen Cngb3R403Q und Cngb3S435F in der beta-Untereinheit des zapfenspezifischen, durch zyklische Nukleotide gesteuerten Ionenkanals. Während die Mutation R403Q in der Porenregion der Kanaluntereinheit lokalisiert ist und einen Austausch der Aminosäure Arginin gegen Glutamin darstellt, beschreibt die Mutation S435F den Austausch von Serin gegen Phenylalanin in der Transmembrandomäne S6. Beide Mutationen sind mit besonderen Formen erblicher Netzhauterkrankungen assoziiert. Das Cngb3-Gen kodiert für die beta-Untereinheit eines zapfenspezifischen Kationenkanals. Dieser Kationenkanal wird durch zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) reguliert und ist von besonderer Bedeutung für die Phototransduktionskaskade. Bei Dunkelheit liegen im Zapfen hohe cGMP-Konzentrationen vor. cGMP bindet an den CNG-Kanal und erhöht so dessen Öffnungswahrscheinlichkeit. Positive Ladung in Form von Na+- und Ca2+-Ionen kann nun vermehrt einströmen. Die resultierende Depolarisation bewirkt eine kontinuierliche Ausschüttung des Transmitters Glutamat an der Synapse des Zapfens. Bei Lichteinfall führt die Anregung des Zapfenopsins zur Aktivierung des Gs-Proteins Transducin. Das aktivierte Transducin bindet die inhibitorische Untereinheit einer Phosphodiesterase und setzt deren katalytische Aktivität frei. Die Phosphodiesterase hydrolysiert cGMP zu 5´-GMP und erniedrigt so den cGMP-Spiegel, woraufhin der CNG-Kanal schließt. Die resultierende Hyperpolarisation unterbindet eine weitere Glutamatausschüttung. Es existieren zahlreiche Mutationen im CNG-Kanal, die zum Teil schwerste Erkrankungen des visuellen Systems hervorrufen. Die Mutationen Cngb3R403Q und Cngb3S435F sind jedoch wegen der variablen Phänotypen und der beobachteten Progressivität der Erkrankung von besonderem Interesse. Die Mutation S435F konnte darüber hinaus als genetische Ursache der „Pingelapese Blindness“, einer auf der Pazifikinsel Pingelap endemischen Form der Achromatopsie, identifiziert werden. Durch die Übertragung der krankheitsassoziierten Mutationen auf die Maus sollen spezifische Tiermodell generiert werden, die es ermöglichen, die patophysiologischen Vorgänge der resultierenden Erkrankungen auf biochemischer, zellulärer und systemischer Ebene zu studieren. Um eine geeignete Knock-In-Strategie entwickeln zu können, wurde zunächst die Genarchitektur des Cngb3-Gens analysiert. Das Gen besitzt 18 Exone, von denen Exon 11 sowohl für die Porenregion als auch für die Transmembrandomäne S6 kodiert. Die gentechnologische Einführung der spezifischen Mutationen ins Genom der Maus beruht auf dem Mechanismus der homologen Rekombination. Die hierfür benötigten Targeting-Konstrukte wurden in zahlreichen Klonierungsschritten generiert. Die fertig gestellten Vektoren wurden per Elektroporation in embryonale Stammzellen der Maus eingebracht. Durch die Verwendung von Selektionsmedium sowie durch eingehende Southern Blot- und PCR-Analysen wurden anschließend Stammzellklone identifiziert, bei denen eine homologe Rekombination stattgefunden hatte. Ausgewählte Klone beider Zelllinien wurden anschließend mit einem Vektor transfiziert, der für die Cre-Rekombinase kodiert. Dieses Enzym ist in der Lage, die von LoxP-Seiten flankierte Selektionskassette wieder aus dem Genom zu entfernen. Auf diese Weise war es möglich, Klone zu gewinnen, bei denen einerseits die Mutation erfolgreich ins Genom eingebracht wurde, andererseits aber zusätzliche Vektorsequenzen wieder eliminiert werden konnten. Für die Cngb3R403Q-Mutation wurden verschiedenen Zellklone per Mikroinjektionstechnik in Blastozysten injiziert und diese in pseudoschwangere Ammenmäuse transferiert. Es wurden mehrere zum Teil hochchimäre Nachkommen geboren, die zur Überprüfung der Keimbahntransmission der Mutation mit Wildtyp-Mäusen verpaart wurden. Da mit diesen Chimären keine Keimbahngängigkeit erzielt werden konnte, wurden wesentliche Teile der Stammzellkultur für das Cngb3R403Q-Konstrukt wiederholt. Von beiden Stammzelllinien stehen abschließend ausreichend Klone für weitere Blastozysteninjektionen zur Verfügung. Darüber hinaus existieren zum Teil hochchimäre Tiere aus weiteren Injektionsversuchen, so dass es möglich sein sollte, die Knock-In-Mauslinien zeitnah zu etablieren. Für eine spätere Expressionsanalyse der modifizierten Kanaluntereinheiten wurde ein spezifischer Antikörper generiert. Als Antigen diente hierzu der hydrophile N-Terminus des Cngb3-Proteins. Der entsprechende cDNS-Abschnitt konnte per RT-PCR aus einer Präparation retinaler RNS der Maus gewonnen und in einen Expressionsvektor einkloniert werden. Durch Expression in E. coli gelang es, ausreichend rekombinantes Protein zu isolieren und aufzureinigen, um mehrere Kaninchen zu immunisieren. Die gewonnenen Antiseren erwiesen sich in immunhistologischen Untersuchungen als selektiv und erlauben den spezifischen Nachweis von Zapfenphotorezeptoren in Netzhautschnitten der Maus.

The present study describes the generation of new knock-in mouse models for the human mutations cngb3R403Q and cngb3S435F in the beta-subunit of the cone specific cyclic-nucleotide gated channel. The mutation R403Q is localized in the pore region of the subunit and is based on the exchange of the amino acids arginine and glutamine. The second mutation S435F describes the exchange of serine and phenylalanine in the transmembrane domain S6. Both mutations are associated with particular manifestations of hereditary retinal deseases. The cngb3 gene encodes the beta-subunit of a cone specific cation channel. This cation channel is gated by cyclic nucleotides, especially by cyclic guanosine monophosphate (cGMP). The channel is of great importance for phototransduction in cones. In darkness, the concentration of cGMP in the cone is high. cGMP associates with the CNG-channel and increases its opening probability. Positive charge, primarily Na+- und Ca2+-ions, can now enter the cell. The resulting depolarization causes a continuous release of the transmitter glutamate at the cell synapse. When light strokes the photoreceptor, the specific cone opsine activates the g-proteine transducin. The activated form of transducin is now able to bind the inhibitory subunit of a phosphodiesterase (PDE) and thereby releases the hydrolytic activity of the PDE. The PDE hydrolyzes cGMP and the intracellular cGMP level decrease until the CNG-channel closes. The resulting hyperpolarization determines the glutamate release. There are a lot of mutations situated in this channel accounting for severe dysfunctions of the visual system. Because of the variable phenotype and the progressive character of the associated deseases, the mutations cngb3R403Q und cngb3S435F arouse special interest. Moreover, the mutation S435F could be identified as the genetic basis of the “pingelapese blindness”, an endemic form of achromatopsia discovered on the pacific island “pingelap”. By transferring the desease associated mutations to the mouse, it is possible to generate specific animal models, which could help to understand the pathophysiology of the cone degeneration on biochemical, cellular and systemic levels in detail. In order to develop an appropriate knock-in strategy the cngb3 gene architecture was analyzed. The gene contains 18 exons. Exon 11 encodes both the pore region and the transmembrane domain S6. The genetic introduction of the mutations into the murine genome is based on the mechanism of homologous recombination in embryonic stem cells of mice. The necessary targeting constructs were generated in numerous cloning steps and finally electroporated into murine stem cells. For both mutations recombinant stem cell clones were identified using selective medium and Southern blot- respectively PCR-analysis. Subsequently, selected clones were transfected with a vector encoding the Cre recombinase. The Cre recombinase is an enzyme, able to remove the selection marker, which is flanked by two loxP sites, from the stem cell genome. In this way it was possible to integrate the mutations into the genome on the one hand and to eliminate the selection marker after the selection step on the other hand. Different R403Q clones were injected into blastocysts and transferred into pseudo-pregnant foster mice. Several highly chimeric mice were born. Mating of these chimeras did not lead to germ-line transmission of the mutation. Hence the essential steps of the stem cell culture for the R403Q mutation were repeated. Finally additional stem cell clones of both cell lines could be isolated and are prepared for further blastocyst injections. Furthermore, new chimeric mice could already be generated by recent injections. According to this, it should be possible to establish the two independent mouse lines contemporary. After the establishment of the desired mouse line, the first investigation will focus on morphology, vital function and fertility. Afterwards the mouse lines are meant to serve as new models for hereditary retinal deseases and contribute to understanding the pathophysiology of this kind of disorders. For future analysis of the expression of the mutated channel subunit in the mouse model, a specific antibody was required. To generate this antibody, the hydrophilic N-terminus of the cngb3-protein was selected as antigene. The according cDNA could be obtained by RT-PCR with retinal RNS preparations of mice serving as template. The cDNA was cloned into an expression vector. The Protein was expressed in E. coli, followed by isolation und purification steps. Finally enough protein could be obtained to immunize several rabbits. First immunochemical analysis demonstrated the selectivity of the resulting immune sera. The generated antibody enables the specific detection of cones in retinal tissue sections of mice.