Role of PI-3 kinases in the regulation of gastric acid secretion

Abstract

PI-3 kinases (eg. SGK, PDK isoforms) are involved in the trafficking of membrane proteins, which include potassium channels (KCNQ1, Kir 4.1) and are known to be critical for gastric acid secretion. Stimulation of PI-3 kinase signalling could thus stimulate the acid secretion. Inhibition of PI-3 kinase signalling on the other hand leads to increase of cAMP levels which in turn could activate the cAMP dependent kinase PKA and thereby lead to stimulation of acid secretion. Therefore considering the significance of PI-3 kinase signalling in other physiological processes, there is an utmost need to clearly define its role in the regulation of gastric acid secretion. SGK1 is an important member of this kinase family and is known to be a potent stimulator of membrane KCNQ1 activity. Therefore the first aim of the study was to determine the role of SGK1 in regulation of gastric acid secretion. The rate of Na+ independent pH recovery after acid load by ammonium pulse (an indicator of H+/K+-ATPase activity) in the glands from SGK1 wild type and knock out mice, however, showed that rate of acid secretion was similar between the two genotypes under both basal and stimulated conditions. It indicates that lack of SGK1 does not make any difference in the regulation of acid secretion. Next step was to study if the overexpression of SGK1 had any effect on the gastric acid secretion. This was done by studying the gastric acid secretion in the mice treated with clinically used drugs that are known to upregulate SGK1 expression (dexamethasone and pioglitazone) and in the mice with defective cellular handling of ß-catenin (apcMin/+ mice), a condition that is known to upregulate genomic SGK1 expression. In-situ hybridisation or western blotting was employed to determine the SGK1 expression in the stomaches from the mice. The experiments revealed an increased SGK1 abundance in the stomaches from mice treated with dexamethsone or with pioglitazone and from apcMin/+ mice. The rate of H+ secretion was increased significantly in isolated glands from dexamethasone treated mice as compared to untreated mice. However the increase was significantly blunted in sgk1-/- mice, clearly demonstrating that dexamethasone induced gastric acid secretion is at least partially dependant on SGK1. Pioglitazone treatment also resulted in significant increase in rate of H+ secretion in sgk1+/+ but not in sgk1-/- mice suggesting that pioglitazone treatment could result in SGK1 dependant increase in gastric acid secretion. The rate of H+ secretion was also enhanced in the apcMin/+ mice. Further experiments showed that the difference between glands from treated (either with dexamethasone or with pioglitazone) and untreated mice of both genotypes was dissipated in presence of increased local K+ concentrations pointing to the role of potassium channels. Similar dissipation of difference was seen in glands from apcMin/+ and apc+/+ mice in presence of increased local K+ concentrations. Experiments conducted by treating the glands with carbachol and/or forskolin also resulted in abrogation of the difference in the rate of H+ secretion, between treated and untreated SGK1 mice of both genotypes and between both genotypes of APC mice, suggesting that there is no genomic upregulation of the secretory machinery (K+ channels). This hypothesis was further confirmed by the real time PCR analysis of KCNQ1 expression in the stomach. Immunoflourescence finally confirmed the increased membrane abundance of H+/K+-ATPase and/or KCNQ1 in the glands from dexamethasone or pioglitazone treated SGK1 wild type mice and in the glands from apcMin/+ mice. FACS analysis of the parietal cells was done additionally in APC mice to quantitatively demonstrate the significant increase in membrane abundance of KCNQ1 channel in apcMin/+ mice. The role of SGK1 in the enhanced gastric acid secretion in apcMin/+ mice was established by the experiments in apcMin/+/sgk1-/- mice which showed that the increase in rate of H+ secretion was abolished by the additional knock out of SGK1. In conclusion, the present studies indicate that overexpression of SGK1 (either due to drug treatment or due to genetic abnormalities) can lead to increase in gastric acid secretion. The next step of this study was to elucidate the role of PI-3 kinase signalling in the regulation of functioning of parietal cell. Since SGK1 was already shown not to be involved in the regulation of basal acid secretion, a kinase above SGK1 in the signalling cascade, PDK1 was chosen as the candidate. Increased rate of H+ secretion was seen in glands from pdk1hm mice suggesting an inhibitory role of PDK1. A clear role overlap of cAMP dependent PKA pathway was seen in the experiments with forskolin, which did not show any additional increase in pdk1hm mice and with H89, which showed inhibitory effect only in pdk1hm mice. Involvement of other pathways was ruled out through experiments with carbachol and phorbol ester. In conclusion, the present study suggests the inhibitory role of PDK1 on the cAMP dependent PKA pathway. The present work thus demonstrates the dual role of the PI-3 kinases in the regulation of gastric acid secretion. On one hand upregulation of these kinases stimulates the secretion by increasing the membrane trafficking of secretory machinery (potassium channels and the proton pump) and on the other hand they inhibit the classical stimulatory pathways (PKA pathway) of acid secretion. The present work has identified that SGK1 is involved in the former effect and PDK1 in the latter effect.

PI-3-Kinasen sind an Membrantransportvorgängen beteiligt, die Kalium Kanäle (KCNQ1, Kir 4.1) miteinbeziehen und entscheidend für die Magensäuresekretion sind. Eine Stimulation des PI-3-Kinasen Signalwegs könnte einerseits die Säuresekretion verstärken, andererseits könnte eine Hemmung des PI-3-Kinasen Signalwegs zu einer Erhöhung des cAMP Gehalts führen, welcher wiederum über Aktivierung der cAMP abhängigen Kinase PKA auch zur Stimulation der Säuresekretion führt. In Anbetracht der Bedeutung des PI-3-Kinasen Signalwegs in anderen physiologischen Prozessen, besteht ein großer Bedarf seine Rolle in der Regulation der Magensäure genau zu bestimmen. Die SGK1 ist ein wichtiges Mitglied dieser Kinasenfamilie und ist als ein starker Stimulator der KCNQ1-Aktivität in der Membran bekannt. Daher war das erste Ziel dieser Studie die Rolle der SGK1 in der Regulation der Magensäuresekretion zu bestimmen. Die Bestimmung der Na+ unabhängigen Erholung des pH nach Säurebelastung durch Ammoniumpulse als Indikator der H+/K+- ATPase Aktivität zeigte, dass die Säuresekretion in Parietaldrüsen von SGK1-Wildtyp und Knock-out Mäusen sowohl unter basalen als auch stimulierten Bedingungen ähnlich war und führte zum Schluss, dass das Fehlen von SGK1 keinen Unterschied in der Regulation der Säuresekretion macht. Der nächste Schritt war, den Effekt der Überexpression von SGK1 auf die Magensäuresekretion zu untersuchen. Dies wurde durch eine Bestimmung der Magensäuresekretion von, mit klinisch gebräuchlichen Medikamenten behandelten, Mäusen, die bekanntermaßen die SGK1 Expression hochzuregulieren steigern (Dexamethason und Pioglitazon). In diesem Zusammenhang wurden auch Mäuse mit dem Gen für die familiäre Adenomatosis polyposis coli (apcMin/+ Mäusen) untersucht, die eine Herunterregulierung von ß-catenin aufweisen, was ebenfalls die SGK1 genomisch hochreguliert. Die SGK1 Expression wurde mittels In-situ Hybridisierung oder Western Blots bestimmt. Dabei zeigte sich eine erhöhte SGK1-Expression in den Mägen von Mäusen, die mit Dexamethason oder mit Pioglitazon behandelt wurden, und von apcMin/+ Mäusen. Im Vergleich zu unbehandelten Mäusen war die Menge der H+ Sekretion in isolierten Drüsen von Dexamethason behandelten Mäusen signifikant erhöht, jedoch war die Erhöhung in sgk1-/- Mäusen signifikant abgeschwächt. Dies bewies, dass eine Dexamethason induzierte Erhöhung der H+ Sekretion zumindest teilweise von SGK1 abhängig ist. Eine Pioglitazonbehandlung bewirkte auch eine signifikante Erhöhung der H+-Sekretion in sgk+/+, aber nicht in sgk1-/- Mäusen, was nahe legt, dass eine Pioglitazonbehandlung SGK1-abhängige Magensäuresekretion zur Folge hat. Die Menge an H+-Sekretion war auch in apcmin/+ Mäusen erhöht. Weitere Experimente zeigten, dass die Stimulierbarkeit (entweder mit Dexamethason oder Pioglitazon) in beiden Genotypen in Anwesenheit von lokal erhöhten K+- Konzentrationen abgeschwächt war, was auf die Rolle der Kaliumkanäle hinwies. Ähnliche Abschwächungen der Stimulierbarkeit wurden in Drüsen von apc Min/+ und apc +/+ Mäusen in Anwesenheit von lokal erhöhten K+-Konzentrationen beobachtet. Die Stimulierbarkeit durch Behandlung mit Carbachol und/oder Forskolin ergaben ebenfalls eine Aufhebung des Unterschieds in der Menge der H+-Sekretion zwischen behandelten und unbehandelten SGK1 Mäusen beider Genotypen und zwischen beiden Genotypen von APC Mäusen, was darauf hindeutet, dass es dieser Effekt nicht durch genomische Hochregulation des Sekretionsmechanismusses zustande kommt, sondern K+-Kanäle einbezieht. Diese Annahme wurde durch Realtime-PCR Analyse der KCNQ1-Expression im Magen weiter bestätigt. Die Immunfluoreszenz bestätigte schließlich die erhöhte Menge an H+/K+ ATPase und/oder KCNQ1 in der Membran der Drüsen von, mit Dexamethason oder Pioglitazon behandelten, SGK1 Wildtypmäusen und in den Drüsen von apc Min/+ Mäusen. Eine FACS Analyse von Parietalzellen wurde zusätzlich bei APC Mäusen durchgeführt, um quantitativ die signifikante Erhöhung der Menge an KCNQ1-Kanäle in apcMin/+ Mäusen in der Membran zu demonstrieren. Die Rolle der SGK1 in der erhöhten Magensäuresekretion in apcMin/+ Mäusen wurde durch Experimente in apcMin/+sgk-/- Mäusen fundiert, die zeigten, dass die Erhöhung der H+ Sekretionsrate durch das zusätzliche Hemmung der SGK1 aufgehoben wurde. Schließlich deuten die derzeitigen Studien an, dass die Überexpression von SGK1 (entweder aufgrund der Medikamentenbehandlung oder durch genetische Abnormalität) zu einer erhöhten Magensäuresekretion führen. Der nächste Schritt dieser Studie war die Rolle des PI-3 Kinase Signalwegs in der Regulation der cAMP Konzentrationen in Parietalzellen aufzuklären. Da schon gezeigt wurde, dass SGK1 nicht an der Regulation der basalen Säuresekretion beteiligt ist, wurde PDK1, eine Kinase oberhalb SGK1 in der Signalkaskade, untersucht. Eine erhöhte H+ Sekretionsrate wurde in Drüsen von pdk1hm-Mäusen gefunden, was daraufhin deutet, dass PDK1 eine hemmende Funktion hat. Eine klare Aufgabenüberschneidung des cAMP-abhängigen PKA-Signalwegs wurde in Experimenten mit Forskolin nachgewiesen, die keinen zusätzlichen Anstieg in pdk1hm Mäusen und mit H89 zeigte. H89 wies einen hemmenden Effekt nur in pdk1hm Mäusen auf. Die Beteiligung von anderen Signalwegen wurde durch Experimente mit Carbachol und Phorbolester ausgeschlossen. Schlussfolgernd deutet die vorliegende Studie auf eine hemmende Rolle der PDK1 auf den cAMP abhängigen PKA Signalweg hin. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie die Doppelrolle der PI-3-Kinasen in der Regulation der Magensäuresekretion. Einerseits bewirkt eine Stimulation dieser Kinasen die Sekretion durch eine Erhöhung des Membrantransportvorgangs (Kaliumkanäle und Protonenpumpe) und andererseits hemmen sie die klassischen stimulierenden Signalwege der Säuresekretion (PKA Signalweg). Die vorliegende Arbeit macht deutlich, dass SGK1 einen frühen und PDK1 einen späten Einfluss auf die Magensäuresekretion hat.