Design and Synthesis of Antisense Peptide Nucleic Acid Conjugated MR Contrast Agents

Abstract

Magnetic Resonance Imaging (MRI) is one of the most important diagnostic tools available in medicine. The specificity and sensitivity of MRI can be further enhanced by the introduction of contrast agents. As many clinically valuable targets reside inside the cell membrane, therefore, developing efficient intracellular targeted MR contrast agent is required. The objective of the present project is to construct novel targeted intracellular MR contrast agents aiming to image mRNA transcription by MRI. The first part of this thesis takes an effort to search for an optimal vector for the intracellular delivery of MR contrast agents. Eight intracellular MR contrast agents, which conjugate different cell-penetrating peptides (CPP) with FITC and Gd(III) complexes, were synthesized by a continuous solid phase synthesis scheme. The key intermediates and final products were characterized by ESI-MS. Relaxivities of these MR contrast agents were measured at a frequency of 123 MHz and a magnetic field of 3 T. The comparison studies of the uptake and toxicity on NIH/3T3 cells suggest that D-Tat57-49 contrast agent could label cells sufficient to enhance significantly relaxation rates R1 and R2 for MR measurements, thus D-Tat57-49 peptide proves to be a useful CPP for the development of new intracellular MR contrast agents. The second part of this thesis describes the design and synthesis of antisense MR contrast agents, which conjugate PNA with CPP, Gd-DOTA and FITC. The intracellular uptake was confirmed by fluorescence spectroscopy, fluorescence microscopy and MR imaging on NIH/3T3 mouse fibroblasts as well as on transgenic dsRed cells. A subtoxic labeling concentration of 0.5 µM is sufficient to enhance significantly MR imaging contrast. The intracellular Gd(III) contents are at the range of 10-9~10-8 mol Gd/107 cells. An in vitro PNA-DNA binding assay confirmed that there is a significant higher specificity of the dsRed antisense contrast agent in comparison to its non-sense counterpart. However, no specific accumulation of the antisense dsRed CA in comparison to the non-sense CA could be detected in the target containing dsRed cells. Fluorescence microscopy studies have showed an exclusive endosomal localization of the contrast agents. Thus, further modifications of the contrast agents are required to achieve the release from endosomes or a direct uptake into the cytosol.

Die Magnetresonanzbildgebung (Magnetic Resonance Imaging, MRI) ist eine der wichtigsten diagnostischen Werkzeuge in der Medizin. Spezifität und Sensitivität in der MRI können durch die Verwendung von Kontrastmitteln weiter verbessert werden. Da viele klinisch wertvolle Ziele innerhalb der Zelle zu finden sind, ist die Entwicklung effizienter, gezielter intrazellulärer MR Kontrastmittel (CA) erforderlich. Ziel dieses Projektes ist es, neuartige gezielte intrazelluläre MR CA zu entwickeln, um mRNA Transkription mit Hilfe der MRI abzubilden. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Suche nach einem optimalen Vektor für die intrazelluläre Aufnahme der MR CA beschrieben. Acht intrazelluläre MR Kontrastmittel, die aus verschiedenen zell-penetrierenden Peptiden (CPP), FITC und Gd(III) Komplexen bestehen, wurden mit Hilfe der kontinuierlichen Festphasen Synthese hergestellt. Wichtige Zwischenprodukte sowie alle Endprodukte wurden mit ESI-MS charakterisiert. Die Relaxivitäten dieser MR CA wurden bei einer Frequenz von 123 MHz und einem Magnetfeld von 3T bestimmt. Vergleichende Untersuchungen zur Aufnahme und Toxizität an NIH/3T3 Zellen zeigten, dass das D-Tat57-49-gekoppelte CA Zellen ausreichend markieren kann, um die Relaxationszeiten R1 und R2 in den MR Messungen signifikant zu erhöhen. Damit konnte gezeigt werden, dass das D-Tat57-49-Peptid ein wertvolles CPP für die Entwicklung neuartiger intrazellulärer MR CA ist. Der zweite Teil der Arbeit beschreibt die Entwicklung und Synthese eines antisense MR CAs, in dem eine PNA-Sequenz mit einem CPP, Gd-DOTA und FITC gekoppelt wurde. Die Aufnahme in die Zellen wurde mit Hilfe von Fluoreszenz-Spektroskopie, Fluoreszenz-Mikroskopie und MR Bildgebung an NIH/3T3 Mausfibroblasten sowie an transgenen dsRed-Zellen bestätigt. Eine subtoxische Konzentration von 0.5 µM war dabei ausreichend, um den Kontrast in den MR Bildern signifikant zu erhöhen. Der intrazelluläre Gd(III)-Gehalt betrug ~ 10-9 – 10-8 mol Gd/107 Zellen. Eine in vitro Untersuchung zur PNA-DNA Bindung bestätigte eine signifikant höhere Spezifität des dsRed-antisense CAs im Vergleich zu seinem non-sense Gegenstück. Allerdings konnte keine spezifische Anreicherung des dsRed-antisense im Vergleich zum non-sense CA in den dsRed Zellen beobachtet werden, die das Zielmolekül enthalten. Die Fluorezenz-mikroskopischen Untersuchungen dieser Zellen zeigten eine ausschließlich endosomale Aufnahme der CA. Daher sind weitere Modifikationen der Kontrastmittel erforderlich, um eine Freigabe aus den Endosomen oder eine direkte Aufnahme in das Zytosol zu erhalten.