cAMP- und cGMP-bindende Tandem-GAF-Domänen: Biochemische Untersuchungen mit einer cyanobakteriellen Adenylatcyclase

Abstract

Die Kristallstruktur der CyaB2 GAF-Domänen ist ein antiparalleles Dimer, das cAMP an GAF A und B gebunden hat. Mit einer Chimäre aus CyaB2-GAF-Domänen und CyaB1 Adenylatcyclase (AC) wurde gezeigt, dass beide GAF-Domänen an der Aktivierung beteiligt sind. Im Vergleich zu anderen GAF-Domänen besitzt CyaB2 als zusätzliches Strukturelement einen 14 (GAF A) bzw. 19 (GAF B) AS langen Einschub zwischen K und F in einem konservierten NKFDE-Motiv. Diese Einschübe sind für eine starke positive Kooperativität der allosterischen Aktivierung durch cAMP verantwortlich. Auch machen sie eine kanonische Salzbrücke zwischen K und D im NKFDE-Motiv entbehrlich. Die Bedeutung des NKFDE-Motivs wurde durch entsprechende D/A-Mutationen in verkürzten Konstrukten nachgewiesen. Dies läßt vermuten, dass es sich bei CyaB2 um eine evolutionäre Zwischenstufe zu den Säuger-Tandem-GAF-Domänen handelt. Der Austausch der CyaB1 gegen die humanen PDE5-Tandem-GAF-Domänen erzeugte eine cGMP-stimulierte AC. Überraschenderweise verhinderten D und/oder K-Mutanten im NKFDE-Motiv in einer oder beiden GAF-Domänen der PDE5 die cGMP-Aktivierung nicht, aber sie erniedrigten die Affinität für cGMP 10- bis 23-fach. Mutationen nur in GAF B erhöhten den Aktivierbarkeitsfaktor, vielleicht ein Indiz dafür, dass GAF B entweder die Bindung von cGMP an GAF A oder die Signalübertragung zum katalytischen Zentrum hemmt. Die Entfernung von 147 N-terminalen Resten erhöhte die Basalaktivität stark, senkte den Aktivierbarkeitsfaktor und reduzierte die EC50 für cGMP. Damit scheint der N-Terminus längenabhängig an der cGMP-Bindung und der Aktivierung der katalytischen Domäne beteiligt zu sein.Untersuchungen zur Nucleotidspezifität der GAF-Domänen wurden mit Chimären aus CyaB1 und Ratten-PDE2 durchgeführt. Die Bereiche wurden gemäß der PDE2-Kristallstruktur ausgewählt. Ein Austausch von EL bis EIRIP erzeugte eine gleichermaßen cAMP- und cGMP-stimulierbare AC. Die Mutation von T258S und L259V schaltete die Aktivierung durch cAMP unter Erhalt der cGMP-Aktiverung weitgehend ab. Damit komme ich zu dem Schluß, dass die Nukleotidspezifität in Tandem-GAF-Domänen nicht durch einzelne AS vermittelt wird sondern wahrscheinlich der Effekt eines ganzen Bereiches sind, der noch im Detail zu untersuchen ist.

The crystal structure of the cyaB2 tandem GAF is an antiparallel dimer with subdomains binding cAMP. Further, both GAF domains stimulate the adenylyl cyclase in a chimera with catalytic domain of the cyaB1 adenylyl cyclase. The GAF domains of cyaB2 possess an added structural element, i.e. within a conserved NKFDE-motif 14 and 19 amino acids are inserted in GAF A and B, respectively. These inserts mediate a highly positive cooperativity of cAMP stimulation. Further, the usually canonical K/D salt bridge within the NKFDE-motif is here dispensable. The importance of the NKFDE motif is demonstrated by corresponding D /A mutations in shortened constructs. This indicates that cyaB2 may be an evolutionary intermediate in relation to the mammalian tandem GAF domains. The swapping of cyaB1 and human PDE5 tandem GAF domains resulted in a cGMP-activated adenylyl cyclase. An S102D mutant in the N-terminal of the PDE5 tandem GAF region which mimics persistent phosphorylation, enhanced cGMP affinity five-fold. D and/or K mutations in the conserved NKFDE motif in one or both GAF domains of PDE5 unexpectedly did not abrogate cGMP stimulation, but lowered cGMP affinity 10 to 23-fold. Mutations in GAF B alone increased total stimulation, potentially indicating that GAF B either inhibits binding of cGMP to GAF A or signaling to the catalytic domain. Removal of 147 N-terminal residues substantially raised basal cyclase activity, lowered total stimulation and reduced the EC50 concentration for cGMP. This effect was observed in a step-wise fashion upon removal of 109 N-terminal amino acids. Concomitantly, the EC50 values decreased. Thus, it appears that the N-terminus is involved in cGMP binding and stimulation of the catalytic domain. Cyclic nucleotide specifity was investigated using chimeras between cyaB1 and rat PDE2 GAF domains. Regions for exchanges were chosen according to the PDE2 crystal structure. A domain swapping between EL and EIRIP resulted in equal stimulation by cGMP and cAMP. In T258S and L259V mutants cAMP stimulation was switched off without affecting cGMP stimulation. Taken together, I conclude that cyclic nucleotide specificity in tandem GAF domains is not mediated by a single amino acid residue but most likely is due to a domain effect which remains to be investigated in detail.