Untersuchungen zur stereospezifischen Pharmakokinetik und Metabolismus von Phenprocoumon bei Erwachsenen und zu Pharmakokinetik und Metabolismus von Piritramid bei Kindern mittels LC-MS-Kopplung

Abstract

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Einsatz der HPLC-Triple-Quadrupol-MS- und HPLC-Ion-Trap-MS-Kopplung für pharmakokinetische Untersuchungen und Metabolitenaufklärung des Antikoagulans Phenprocoumon (Marcumar) und des Opioid-Analgetikums Piritramid (Dipidolor). Es wurde eine LC-Triple-Quadrupol-MS-Methode mit vorangehender konventioneller Festphasenextraktion für die stereoselektive Messung von Phenprocoumon aus Humanplasma entwickelt und eine Methodenvalidierung durchgeführt. Die Methode umfasst einen linearen Messbereich von 62.5-1000 ng/ml (pro Enantiomer) bei einer Wiederfindungsrate von >89 % und einer Präzision von 3.24-7.01 % (Variationskoeffizient) sowie einer Richtigkeit von -9.04 - +3.02 %. Anhand der Plasmakonzentrationswerte bei Cytochrom-P-450-2C9-genotypisierten Probanden konnte gezeigt werden, dass der CYP2C9 Genotyp auf die stereospezifische Pharmakokinetik von Phenprocoumon im Gegensatz zu Warfarin keinen signifikanten Einfluss hat. Mittels HPLC-Ion-Trap-MS-Messungen konnten zwei weitere Phenprocoumon-Metabolite identifiziert werden: 2'-OH-Phenprocoumon und ein aliphatisch hydroxylierter Metabolit. Stereoselektive Messungen der fünf Phenprocoumon-Metabolite mit Hilfe einer zweidimensionalen HPLC-MS-Kopplungstechnik zeigten, dass alle Metabolite stereoselektiv, meist mit einem deutlichen (R)-Enantiomer-Überschuss, gebildet werden und für die neu entdeckten Metabolite - im Gegensatz zu den bekannten - keine Abhängigkeit vom CYP2C9-Genotyp vorliegt. Für die Messung von Piritramid aus Humanplasma bzw. -urin wurde eine off-line-SPE-LC-MS/MS- bzw. on-line-SPE-LC-MS/MS-Methode entwickelt und validiert. Die Methode ist linear im Bereich von 0.5-100 ng/ml, das LOD liegt bei ca. 0.05 ng/ml. Hinsichtlich Richtigkeit, Präzision, Selektivität, Wiederfindung (>90 %), Matrixeinflüssen und Probenstabilität erfüllt sie die für bioanalytische Assays geltenden Anforderungen. Die pharmakokinetischen Parameter Cmax, tmax, AUC(0-180min) und t1/2 wurden bei 25 Kindern im Alter von 6.4-43.6 Monaten ermittelt. Die Cmax-Werte von Piritramid betrugen 35.4 +/-8.9 ng/ml (Mittelwert +/-SD), tmax 7.0 +/-4.2 min, die AUC(0-180min) 2600.3 +/-617.8 min*ng/ml und t1/2 188.6 +/-62.4 min. Die pharmakokinetische Kompartiment-Analyse ergab für die einmalige iv-Bolusgabe von 0.1 mg/kg KG Piritramid für das Zweikompartiment-Modell die beste Anpassung. Außer für die dosisnormierte AUC(0-180min) gab es zwischen den zwei Altersgruppen (6.4-12.2 und 17.1-43.6 Monate) keine signifikanten PK-Unterschiede. Die Pharmakokinetik-Daten der Kinder-Studienpopulation wurden mit Daten einer früheren Studie mit erwachsenen Patienten verglichen. Dabei ergaben sich für die Auswertung bis sechs Stunden nach Dosisgabe im Wesentlichen Unterschiede für das zentrale Verteilungsvolumen (Kinder: 2.1 l/kg, Erwachsene: 1.4 l/kg) und die Halbwertszeit für die zweite (höchstwahrscheinlich noch nicht terminale) Eliminationsphase (Kinder: ca. 3 h, Erwachsene: ca. 4,5 h). Insgesamt konnten acht Piritramid-Metabolite aus Rattenlebermikrosomeninkubat identifiziert werden, von denen sechs auch in Humanurin- und -mikrosomenproben vorhanden sind. Dabei handelt es sich um drei Dihydroxy-, vier Monohydroxy- und einen Dehydro-Piritramid-Metaboliten. Mittels ESI-Ion-Trap-MS konnten die hydroxylierten Regionen im Molekül eingegrenzt, wenn auch letztlich nicht vollständig strukturell aufgeklärt werden. Nach den vorliegenden Daten liegen zwei aromatische Hyxdroxylierungen sowie im endständigen Piperidinring eine N-Oxidierung oder eine Hydroxylierung in alpha-Position zum Stickstoff und im gleichen Ring eine Dehydrogenierung vor.

This work deals with the use of HPLC-triple-quadrupole-mass-spectrometry- and HPLC-ion-trap-mass-spectrometry for pharmacokinetic studies and metabolite identification of the oral anticoagulant Phenprocoumon (Marcumar) and the opiate-analgesic Piritramide (Dipidolor). An LC-triple-quadrupole-MS method with preceding conventional solid-phase sample extraction for the stereoselective quantification of phenprocoumon in human plasma was developed and a method validation was performed. The method comprises a linear range from 62.5-1000 ng/ml (per enantiomer) with a recovery of >89 %, precision of 3.24-7.01 % (coefficient of variation) and accuracy of -9.04 - +3.02 %. In contrast to Warfarin, the phenprocoumon plasma concentration-time-curves of CYP2C9 genotyped adult volunteers revealed no significant influence of the CYP2C9 genotype on the stereospecific pharmacokinetics of phenprocoumon. Two additional novel phenprocoumon-metabolites could be detected and partially structurally identified by HPLC-ion-trap-MS analysis: 2'-OH-Phenprocoumon and an aliphatically hydroxylated metabolite. Stereoselective pharmacokinetic analysis of the five phenprocoumon-metabolites by means of a two-dimensional HPCL-MS coupling technique showed that all metabolites are produced stereoselectively, mostly with a marked excess of the (R)-enantiomer. For the two novel metabolites - in contrast to the known metabolites - dependence on the CYP2C9 genotype was not found. For the quantification of Piritramide in human plasma and urin, respectively, an off-line-SPE-LC-MS/MS and an on-line-SPE-LC-MS/MS method was developed and validated. The method is linear in the range of 0.5-100 ng/ml with an LOD of ca. 0.05 ng/ml. As far as accuracy, precision, selectivity, recovery (>90 %), influence of matrix effects and sample stability are concerned, it complies with current standards for bioanalytical assays. The pharmacokinetic parameters Cmax, tmax, AUC(0-180min) and t1/2 were measured in 25 pediatric patients with an age of 6.4-43.6 months. The Cmax values of Piritramide were 35.4 +/-8.9 ng/ml (mean +/-standard deviation), tmax 7.0 +/-4.2 min, AUC(0-180min) 2600.3 +/-617.8 min*ng/ml and t1/2 188.6 +/-62.4 min. The compartmental pharmacokinetic analysis revealed the best fit for the two-compartment-model for a single iv-bolus of 0.1 mg/kg body weight Piritramide. Apart from the dose-related AUC(0-180min) there were no significant differences between the two age groups (6.4-12.2 and 17.1-43.6 months). The pharmacokinetic data of the pediatric study population was compared with data of a previous study with adult patients. The pharmacokinetic analysis of the interval 0-6 hours after iv-bolus administration essentially resulted in differences for the central volume of distribution (children: 2.1 l/kg, adults: 1.4 l/kg) and for the plasma half-life of the second (presumably not yet terminal) elimination phase (children: ca. 3 h, adults: ca. 4.5 h). Altogether eight Piritramide metabolites could be detected in rat liver microsomes, six of which were also present in human urin and microsome samples. These compounds were identified as three isomeric dihydroxy-, four monohydroxy-Piritramide-metabolites and one dehydro-metabolite. By means of ESI-ion-trap-MS the hydroxylated region within the molecules could be narrowed down, but not yet fully structurally elucidated. According to the present data the metabolites feature two aromatic hydroxylations, an N-oxidation or aliphatic hydroxylation in alpha-position to the nitrogen atom within the terminal piperidine-ring and dehydrogenation in the same ring.