Charakterisierung und Nachweis des E8^E2C Repressorproteins des humanen "high-risk" Papillomvirus Typ 31 (HPV31)

Abstract

Infektionen mit humanen Papillomviren (HPV) induzieren benigne Tumoren der Haut oder Schleimhaut, die besonders bei den sogenannten "high risk"-Typen wie 16, 18, 31 und 45 ein hohes Risiko der malignen Konversion besitzen. Der Replikationszyklus von Papillomviren ist eng an den Differenzierungsgrad des infizierten Epithels gekoppelt. In undifferenzierten Keratinozyten liegt eine persistente Infektion vor, bei der nur eine limitierte DNA-Replikation und Expression der frühen Gene stattfindet, aber keine Virusproduktion. Zunehmende Differenzierung infizierter Keratinozyten resultiert in einer Amplifikation der Virusgenome sowie in der Expression der späten viralen Proteine. Die virale DNA-Replikation wird positiv und negativ durch zwei virale, sequenzspezifisch DNA-bindende Proteine reguliert, welche vom E2 Gen kodiert werden und durch alternatives Spleißen entstehen. Das E2 Protein aktiviert die virale DNA-Replikation und reguliert die virale Genexpression. Das E8^E2C Protein von HPV31 reprimiert die DNA-Replikation und wirkt als Repressor des frühen Promotors P97, der für die Expression der viralen Onkogene E6 und E7 verantwortlich ist. Im Rahmen dieser Arbeit sollten für die Repression durch HPV31 E8^E2C erforderliche cis- und trans-Elemente identifiziert und charakterisiert werden. Mutationsanalysen der vier E2 Bindungsstellen (E2BS) im P97 Promotor zeigten, daß das E8^E2C Protein, im Gegensatz zu E2, eine E2BS-abhängige, transkriptionelle Fernrepressionsaktivität besitzt, für welche die unter HPV hochkonservierte E8-Domäne verantwortlich ist. E8^E2C inhibierte auch den HPV6a P2 Promotor, den minimalen frühen SV40 Promotor und den minimalen späten Adenovirus Hauptpromotor in der Anwesenheit von E2BS. Eine "Alanin-Scanning"-Mutagenese der E8-Domäne identifizierte die Aminosäuren W6 und K7 als spezifisch für die Ferndistanzrepressionsaktivität. Die Mutation der Aminosäuren W6 und K7 von E8^E2C im Kontext des HPV31 Genoms resultierte in einer starken Überreplikation der Genome, ähnlich der von HPV31 E8^E2C "Knock-out"-Mutanten. Überraschenderweise war die Überreplikation nicht eine Folge einer erhöhten viralen Genexpression, was auf eine direkte Beteiligung von E8^E2C bei der Inhibition der DNA-Replikation hinwies. Fusionsproteine der ersten 12, 21 und 37 Aminosäuren von E8^E2C mit der heterologen GAL4-DNA-Bindungsdomäne legten die ersten 21 Aminosäuren als minimale Repressionsdomäne für die Transkription und virale DNA-Replikation fest. Diese Experimente zeigten, daß die postulierte Bindungsstellenkompetition und Ausbildung von inaktiven Heterodimeren zwischen E2 und E8^E2C Proteinen nicht wesentlich zur Replikationskontrolle bei HPV31 beitragen. Die minimale Repressionsdomäne genügte zur Repression des heterologen EBV-Replikationsursprungs oriP, der den Kontrollmechanismen unterliegt, welche dafür verantwortlich sind, daß das zelluläre Genom exakt einmal pro Zellzyklus repliziert wird. Zusammenfassend legen diese Daten nahe, daß E8^E2C einen generellen Inhibitor von extrachromosomal-replizierenden, karzinogenen Viren des Menschen darstellt, was wichtige Implikationen für die Entwicklung neuartiger antiviraler Therapien besitzt.

Infections with human papillomaviruses (HPV) induce benign cutaneous or mucosal tumours with the potential of malignant conversion, especially in the case of "high risk" HPV types 16, 18, 31 and 45. The replication cycle of papillomaviruses is tightly linked to the differentiation state of the infected epithelia. In undifferentiated keratinocytes only exists a persistent infection with limited DNA replication and expression of early genes, but without any virus production. Further differentiation of infected keratinocytes results in the amplification of viral genomes and the expression of viral late proteins. Viral DNA replication is positively and negatively regulated through two viral sequence specific DNA binding proteins which are encoded by the E2 gene and result from alternative splicing mechanisms. The E2 protein acts as an activator of viral DNA replication and regulates viral gene expression. The E8^E2C protein of HPV31 represses DNA replication and also the early viral promoter P97, which controls the expression of the viral oncogenes E6 and E7. The aim of this study was to identify and characterize the cis and trans elements necessary for repression by HPV31 E8^E2C. Mutational analyses of the four P97 E2 binding sites (E2BS) demonstrated, in contrast to E2, an E2BS dependent long-distance transcriptional repression (LDTR) activity of the E8^E2C protein, which was dependent on the highly conserved E8 domain. E8^E2C also inhibited the HPV6a P2 promoter, the minimal SV40 early promoter and the minimal adenovirus major late promoter in the presence of E2BS. Alanine-scanning mutagenesis of the E8 domain revealed that large-distance repression activity is largely dependent on amino acids W6 and K7. Mutation of amino acids W6 and K7 of E8^E2C in the HPV31 genome resulted in a strong overreplication, similar to HPV31 E8^E2C knock-out mutants. Surprisingly, overreplication did not result from an increase in viral gene expression, indicating to a direct participation of E8^E2C at the inhibition of DNA replication. Fusion proteins between the first 12, 21 and 37 amino acids of E8^E2C and the heterologous GAL4 DNA binding domain revealed the first 21 amino acids as a minimal repression domain for transcription and viral DNA replication. According to these results, the postulated binding site competition and formation of inactive heterodimers between E2 and E8^E2C proteins contribute not essentially to the copy-number control of HPV31. The minimal repression domain was sufficient to repress the heterologous EBV replication origin oriP, which is subjected to control mechanisms responsible for the once per cell cycle replication of the cellular genome. Taken together, these findings suggest that E8^E2C represents a general inhibitor of extrachromosomal replicating carcinogenic human viruses, which possesses important implications for the development of novel antiviral therapies.