Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die Zytopathogenität von Pestiviren

Abstract

Das Virus der bovinen viralen Diarrhöe (BVDV) und das Virus der klassischen Schweinepest (CSFV) sind umhüllte Viren, die dem Genus Pestivirus der Familie Flaviviridae angehören. Das Genom besteht aus einer einzelsträngigen RNA positiver Polarität und kodiert für ein etwa 4000 Aminosäuren langes Polyprotein, welches ko- und posttranslational in die reifen Virusproteine gespalten wird. BVD-Viren werden aufgrund ihres Verhaltens in der Zellkultur in zytopathogene (zp) und nicht zytopathogene (nzp) Viren unterteilt. Im Vergleich mit den nzp BVD-Viren weisen die bisher analysierten zp BVD-Viren verschiedene Genomveränderungen auf, die das Ergebnis von RNARekombinationsvorgängen sind. Zu diesen Veränderungen zählen: (1) Insertionen zellulärer Sequenzen, (2) Duplikationen viraler Sequenzen, (3) Insertion einer viralen Sequenz in einem anderen Leseraster und (4) Deletionen. Aufgrund dieser Genomveränderungen kommt es zur kostitutiven Expression eines für zp BVD-Viren spezifischen Proteins, des NS3, welches das carboxyterminale Spaltprodukt von NS2/3 darstellt und in nzp- Virus infizierten Zellen nur transient, im Frühstadium der Infektion auftritt. NS2/3 wird sowohl in zp- als auch in nzp-BVDV infizierten Zellen dauerhaft exprimiert. Viren der klassischen Schweinepest hingegen exprimieren sowohl das Nichtstrukturprotein NS2/3 als auch dessen Prozessierungsprodukte NS2 und NS3, ohne dass es zur Ausbildung eines ZPE kommt. Auch für das CSF-Virus konnten zp Biotypen nachgewiesen werden. Diese entstehen wie auch bei den nahe verwandten BVD-Viren durch RNA-Rekombinationsprozesse. Alle bisher bekannten zp CSFV weisen die gleiche Konstruktion auf. Es handelt sich um sogenannte defekte interferierende Partikel (DI), die denen der BVDV ähneln. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der NS2/3-Spaltstelle sowohl beim zp BVDV-Stamm Oregon als auch beim nzp CSFV-Stamm Alfort. Um die Genomregion zu untersuchen, die die Information für die Spaltstelle NS2/3 trägt, wurden von beiden Viren verschiedene Mutanten erzeugt und die Spaltung des NS2/3 in NS2 und NS3 beurteilt. Im Anschluss an diese Expressionsuntersuchungen wurden die erhaltenen Viren auf ihre Lebensfähigkeit hin untersucht. Es stellte sich heraus, dass eine Veränderung der NS2/3-Spaltstelle große Auswirkung auf die Vitalität der überprüften Viren hat. Für das BVD-Virus Stamm Oregon heißt dies, dass trotz teilweise mit dem Wildtyp vergleichbaren Prozessierungsraten keine die Mutation tragenden Viren über einen längeren Zeitraum stabil waren. Alle untersuchten Mutanten revertierten innerhalb der ersten fünf Passagen. Ein etwas anderes Verhalten zeigte sich beim untersuchten CSFV-Stamm. Hier konnten drei stabile Mutanten erhalten und analysiert werden. Erstaunlicherweise erwiesen sich Mutanten an den Positionen P1 und P1’ als stabil. Dies ist insofern interessant, da in der Natur nur Viren beobachtet werden, deren Aminoterminus des NS3 durch ein Glycin dargestellt wird. In Spaltungsuntersuchungen zeigte sich darüber hinaus, dass diese Mutanten das NS2/3 in mit dem Wildtyp-Virus vergleichbaren Mengen spalten. Bei BVDV-Feldisolaten ist die konstitutive Expression des BVDV-NS3 stets mit der Zytopathogenität korreliert. In Mutationsstudien konnte durch die Substitution eines Tyrosins durch Cystein in einem sehr konservierten Bereich des NS4B eine nzp Variante des BVDV erhalten werden, die konstitutiv NS3 in erheblichen Mengen exprimiert. Diese Variante wies die Substitution YC im NS4B auf. In der vorliegenden Arbeit wurde eine entsprechende Veränderung in das Genom des zp BVDV (CP7), des nzp BVDV (NCP7) und des nzp BVDV-2 (NewYork ’93) eingeführt. Das veränderte Mut-CP7-Virus induzierte im Gegensatz zum CP7 keinen ZPE in den infizierten Zellen, so dass damit gezeigt ist, dass die YC Mutation im NS4B den Phänotyp verschiedener zp Viren in gleicher Weise ändert. Viren der klassischen Schweinepest setzen das NS3 konstitutiv frei. Trotz der Menge an gebildetem NS3, die teilweise weit über das Level von Mut-NS4BCP7 hinausgeht, finden sich in der Regel nur nzp CSFV-Stämme. Zur Abklärung, ob auch bei nzp Viren ein Einfluss durch eine Veränderung im NS4B zu beobachten ist, wurden entsprechende Mutationen auch in nzp BVD- und nzp CSF-Viren eingebracht. Signifikante Wachstumsunterschiede konnten ebenso wenig beobachtet werden wie phänotypische Abweichungen. Unterschiede ergaben sich allerdings in der Menge an gebildeter RNA, wenngleich hier kein einheitliches Verhalten zu beobachten war. Die Rolle des NS4B bei der Entstehung des ZPE bleibt weiterhin offen. Die untersuchte Mutation befindet sich im N-Terminus des NS4B, einer Region, die vermutlich auf der zytoplasmatischen Seite intrazellulärer Membranen lokalisiert ist und dort möglicherweise mit anderen viralen oder zellulären Proteinen interagiert.

Pestiviruses are belonging to the family of Flaviviridae. The Virus of bovine viral diarrhoe (BVDV) is separated into two biotypes, cytopathogenic (cp) and non cytopathogenic (ncp) BVDV. Here we examined the influence of mutations at the NS2/3 cleavage site and inside the NS4B onto the cytopathogenic biotype.