Entwicklung eines Produktions- und DNA-Verpackungssystems für Virus-ähnliche Partikel des humanpathogenen Papillomavirus Typ 16

Abstract

Die weltweit verbreiteten Papillomaviren sind kleine unbehüllte DNA-Viren, die eine ausgeprägte Wirts- bzw. Gewebsspezifität besitzen und sich ausschließlich in den oberen Schichten von Haut- und Schleimhautepithelien vermehren. Die Infektion dieser Viren verläuft beim Menschen in der Regel inapparent, kann aber in Abhängigkeit vom Virustyp auch zur Entstehung der zweithäufigsten Krebsart bei Frauen - dem Zervixkarzinom - führen. Das Virusgenom wird von mehreren Kopien der zwei Strukturproteine L1 und L2 ein-geschlossen und bildet somit die infektiöse Einheit. Die genauen Abläufe beim Kapsidassemblierungs- und Verpackungsprozess sowie die Vorgänge bei der Auf-nahme und Prozessierung der Viren sind noch weitgehend ungeklärt. Die Möglichkeit zur künstlichen Herstellung dieser Viren ist eine wichtige Voraussetzung zur Erfor-schung der zuvor genannten Prozesse, bei denen große Mengen an infektiösem Vi-rusmaterial benötigt werden. Die Herstellung dieser Viren im Labor hat sich aber als kompliziert erwiesen, da die Expression der Strukturproteine sehr stark reguliert und eng mit dem Differenzierungsprogramm der Zelle verknüpft ist. Bis heute wurde eine Vielzahl an Produktionssystemen entwickelt, deren Nachteile v.a. durch geringe Ausbeuten, hohen technischen Aufwand oder durch unkontrollierbare Beeinflussungen des zellulären Programms gekennzeichnet sind. Die Modifikation bestimmter Kodons der späten Gene erwies sich im Vorfeld dieser Arbeit als ein entscheidendes Werkzeug zur Durchbrechung der strikten Expressionsregulation. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, in wie fern und in welchen Mengen die Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln in einfachen Zellkultursystemen unter Verwendung der kodon-optimierten Strukturgene möglich ist. Ein einfaches und zügig durchführbares Verfahren zur Herstellung von humanisierten VLPs in Säugetierzellen konnte im Folgenden entwickelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die VLPs am besten in 293T Zellen durch Kotransfektion herzustellen sind und dass die Menge der transfizierten Einzelkomponenten (hL1, hL2 und Verpackungsplasmid) zueinander entscheidende Auswirkungen auf die zu erwartende Gesamtmenge an VLPs besitzen. Die zusätzliche Transfektion von E1 oder E2, die bezgl. ihrer Beteiligung am Assemblierungs- und Verpackungsprozess für Papillomaviren zur Diskussion stehen, konnte unter den verwendeten Bedingungen keinen Beitrag zur Effizienzsteigerung des Produktionssystems leisten. Die reproduzierbaren VLP-Ausbeuten konnten mit Hilfe eines bereits entwickelten ELISA-Systems ("capture-ELISA") quantifiziert und mit Standardproduktionstechniken verglichen werden. Daneben stellte sich heraus, dass im Rahmen von Sedimentationsanalysen im Saccharosegradienten insgesamt betrachtet Apoptose oder/und Ultraschall die am besten geeigneten Zellaufschlussmethoden sind, wenngleich Frier/Tau-Zyklen die effektivste Herauslösung von Strukturproteinen aus Zellen bewirken konnten. Weiterhin wurde eindeutig nachgewiesen, dass die Verwendung von vorgeklärtem Zell-Lysat in Infektionsexperimenten unter der Beachtung korrekter Kontrollen lediglich zu unspezifischen Transduktionen des verpackten Plasmids führt. Schließlich konnte auch die Inkubation von virusneutralisierenden Antikörpern die unspezifische Transduktion der verpackten (Reporter-) DNA nicht beeinflussen, wodurch eine Beteiligung von kapsidartigen Strukturen beim beobachteten Transdukti-onsprozess ausgeschlossen werden konnte. Im zweiten Teil wurde verfolgt, in wie fern eine weitere Aufreinigung der Zell-Lysate von Nöten ist, um die möglicherweise für die unspezifische Transduktion verantwortliche - DNase bzw. RNase resistente - DNA/RNA zu eliminieren. Durch den Einsatz von Sedimentationsanalysen konnten somit voneinander unterscheidbare, morphologische Assemblierungsgruppen identifiziert und quantifiziert werden. Es konnten Kapsomer-, Intermediaten- und VLP-Fraktionen identifiziert und visualisiert werden. Außerdem konnte eine zusätzliche, bisher unbeobachtete Fraktion ermittelt werden, die der VLP-Fraktion stets vorgelagert war. Dabei könnte es sich möglicherweise um Fraktionen handeln, in denen VLPs enthalten sind, in die das eingesetzte Targetplasmid verpackt ist (PVs). Der Nachweis von konformationsspezifischen Eigenschaften dieser Fraktion(en) konnte mittels ELISA bestätigt werden. Weder die Aufkonzentrierung dieser hypothetischen PVs noch die erfolgreiche Transduktion von Zellen mit diesen Fraktionen konnte bisher erzielt werden. Der in dieser Arbeit unter standardisierten Zellkulturbedingungen entwickelte Ansatz zur Produktion von VLPs durch kodon-optimierte Strukturgene ist viel versprechend und könnte einen wichtigen Beitrag bei der Erforschung des Partikelassemblierungs-prozesses leisten. Auch die bisher noch nicht gelungene Herstellung funktioneller Pseudovirionen könnte sich durch weitere methodische Verbesserungen zu einem wichtigen Mittel zur Klärung der Prozesse bei und nach Virusaufnahme in die Zelle entwickeln.

Human papillomavirus type 16 (HPV 16) belongs to the "high risk" subset of genital HPVs which are the most causative agents for epithelial cancers of the uterine cervix. Worldwide, this type of cancer is the second leading cause of cancer death in women - behind breast cancer - and is the most common form of cancer in developing countries. Since the production of infectious human papillomaviruses is not possible by simple cell culture techniques, it is a desirable goal to develop an efficient in vitro system, which is able to eliminate the lack of virion availability. Although early gene expression and DNA replication can be achieved in various cell lines, the expression of HPV 16 late genes encoding the capsid proteins L1 and L2 is tightly regulated and restricted to terminally differentiated epithelial cells. It is still unclear which structure or process is responsible for this tight regulation that additionally determines the species and tissue specificity of the HPVs. In this work we show that humanisation of viral late gene codons leads to significantly improved expression of HPV16 L1 and L2 under the control of heterologous promoters. In addition we show that HPV16 Virus-like Particles can be easily produced in standard cell culture systems and might be packaged with a special packaging plasmid. Packaged Virions can be distinguished from unpackaged material via sucrose sedimentation analysis.