Mikroarrays zur Messung von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen mit konfokaler Fluoreszenzdetektion

Abstract

Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen wurden auf Mikroarrays untersucht. Die eingesetzte Oberflächenchemie ermöglichte gleichzeitig eine einfache Arrayherstellung sowie für spätere Fragestellungen die Unterdrückung des Wachstums adhärenter Zellen außerhalb des Arrays. Die für die Untersuchung gewählte konfokale Fluoreszenzmikroskopie erwies sich als geeignet, sowohl die Oberflächenchemie zu optimieren als auch schwächere Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen zu untersuchen, als sie bei DNA- oder Antikörpermikroarrays üblich sind. So ließ sich die konfokale Detektion in Kombination mit einer Bindungstitration u.a. zur Messung von Bindungskonstanten im Arrayformat für das Modellsystem Vancomycin anwenden. Ebenso ließ sich auf den entwickelten Oberflächen der Aktivierungszustand eines Proteins in Abhängigkeit von einer vorangegangenen Zellstimulation durch Inkubation der Mikroarrays mit unaufgereinigtem Zelllysat untersuchen. Weitere Untersuchungen widmeten sich dem Einfluss unterschiedlicher Fluorophore auf die beobachteten Wechselwirkungen sowie dem Einfluss der Rezeptordichte auf die Bindungsstärke.

Interactions between small molecules were investigated on microarrays. The applied surface chemistry allowed a simple generation of the arrays and at the same time, for future questions, the suppression of cell growth outside the arrays. Confocal fluorescence microscopy proved to be useful for both optimisation of the surface chemistry and investigation of receptor-ligand-interactions weaker than those usually occurring on DNA or antibody microarrays. In combination with binding titrations, confocal detection could be applied to determine binding constants in an array format for vancomycin as model system. Also, the activation state of a protein, depending on a preceding stimulation of cells, could be investigated by incubating microarrays with crude cell lysate. Further experiments determined the influence of different fluorophores on the observed interactions and the influence of receptor density on the strength of binding.