Quantifizierung nativer mRNA

Abstract

Zur Produktion pharmazeutisch relevanter Proteine, wie zum Beispiel von Wachstumsfaktoren, werden rekombinante Mikroorganismen, wie E.coli oder die Hefe Pichia Pastoris, eingesetzt. Ob die Effektivität der Transkription des eingefügten Gens, d.h. der Menge der gebildeten mRNA, oder andere Faktoren, zum Beispiel die Translation in Genprodukte, die Produktivität des Prozesses bestimmen, kann durch die quantitative Analyse der Genprodukte ermittelt werden. Daher nimmt auch bei der Entwicklung optimaler Produktionsstämme die mRNA-Bestimmung eine wichtige Rolle ein. Bisherige Methoden erlauben nur eine Abschätzung von mRNA-Konzentrationen und sind außerdem sehr zeitaufwändig, da sie auf der Trennung von mRNAs über Gelelektrophorese, ihrem Transfer auf Membranen durch Blotten und dem anschließenden spezifischen Nachweis durch Hybridisierung oft radioaktiv markierter Sonden, d.h. spezifischer Oligonukleotide, beruht. Neuere Methoden beruhen auf sogenannten DNA-Chips, bei denen Oligonukleotide auf einem Substrat, häufig auf Glasträgern, immobilisiert sind. Die mRNA wird durch reverse Transkription gegebenenfalls mit anschließender PCR in fluoreszierende Produkte umgesetzt, mit dem Chip inkubiert und anschließend die Fluoreszenz ausgewertet. mRNAs aus eukaryontischen Zellen, z.B. Hefen, besitzen an ihrem 3´-Ende einen sogenannten polyA-Schwanz, der der mRNA aus prokaryontischen Zellen (E. coli) fehlt. Damit ergibt sich bei der mRNA aus eukaryontischen Zellen die Möglichkeit, polyT-Oligonukleotide als generelle Erkennungssequenz einzusetzen. Ziel unserer Arbeiten ist es, Methoden zu etablieren, bei denen mRNAs aus eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen direkt, ohne weitere Modifi-zierungsreaktionen eingesetzt werden können. Dies sollte am Beispiel der mRNA des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors (bFGF) erfolgen.