Identifizierung krankheitsassoziierter MHC-Liganden durch massenspektrometrische Verfahren

Abstract

In dieser Arbeit wurden neue T-zellunabhängige Methoden zur gezielten Identifizierung krankheitsassoziierter MHC-Liganden durch massenspektrometrische Verfahren entwickelt und getestet. Der 'Predict, Calibrate, Detect' (PCD)-Ansatz, eine Verbindung von Epitopvorhersage und HPLC-Massenspektrometrie, ermöglichte die Identifizierung neuer HLA-A2-Liganden aus den tumorassoziierten Proteinen CEA, p53 und MAGE-A1 mit einer Empfindlichkeit von bis zu <10 Kopien/Zelle. Für CEA694-702 konnte zudem auch die Präsentation auf einem soliden Gastrointestinalkarzinom nachgewiesen werden. MAGE-A1278-286 konnte inzwischen in transgenen Mäusen als CTL-Epitop eindeutig verifiziert werden, für die Liganden aus p53 und CEA sind Versuche dazu noch im Gange. Diese Peptide sind Kandidaten für eine peptidspezifische Immuntherapie bei Tumoren. Die Voraussetzung für den PCD-Ansatz und weitere Ansätze zur Identifizierung von CTL-Epitopen aus definierten Antigenen sind allelspezifische Peptidmotive, die eine Epitopvorhersage für diese Protein erlauben. Mit der Bestimmung des Peptidmotive für HLA-B*1510- und HLA-DQ(a1*0201/b1*0202) wurden hierfür die Grundlagen erweitert. Daneben gelang die Charakterisierung des ersten CTL-Epitops aus dem Borna Disease Virus, das zugleich den ersten virusspezifischen MHC-Liganden aus der Ratte darstellt. Weiterhin konnten durch Nanoelektrospray-MS/MS-Analyse MHC-Klasse II-Liganden aus dem IDDM-relevanten Autoantigen GAD65 identifiziert werden und damit eine neue Methode zur spezifischen Detektion von MHC-Liganden aus einem definierten, radioaktiv markierten Antigen erfolgreich getestet werden. Schließlich konnten mit der puromycin-sensitiven Aminopeptidase und der Bleomycinhydrolase zytosolische Proteasen durch Nanoelektrospray-MS/MS-Analyse identifiziert werden, die wahrscheinlich an der N-terminalen Verkürzung proteasomaler Verdauprodukte beteiligt sind und damit eine wichtige Rolle bei der MHC Klasse I-Antigenprozessierung spielen könnten.

This thesis describes the development and evaluation of novel T cell-independent strategies for the identification of disease-associated MHC-ligands by mass spectrometry. The 'Predict, Calibrate and Detect' (PCD)-approach, a combination of epitope prediction and HPLC-mass spectrometry, allowed the identification of new HLA-A2-ligands from the tumor-associated proteins CEA, p53 and MAGE-A1 with a sensitivity of <10 copies/cell. Moreover, for CEA694-702 presentation on a solid gastrointestinal carcinoma could be shown. MAGE-A1278-286 could be verified as a CTL-epitope in transgenic mice, while the p53 and CEA-derived ligands are still under investigation. These peptides are candidates for the peptide-specific immunotherapy of tumors. Allel-specific peptide motifs are the main prerequisite for the PCD-approach as well as for other strategies that employ epitope prediction for the identification of CTL-epitopes from defined antigens. The determination of the peptide motifs of HLA-B*1510 and HLA-DQ(a1*0201/b1*0202) has paved the way for epitope prediction for these alleles. Moreover, the first Borna Disease Virus-derived CTL-epitope could be characterized. which also represents the first known virus-derived MHC-ligands from the rat. Furthermore, MHC class II-ligands from the diabetes-relevant autoantigen GAD65 could be identified by nanoelectrospray MSMS analysis, using a novel approach for the specific detection of MHC-ligands from a defined antigen by radioactive labeling of the protein. Finally, nanoelectrospray MSMS analysis allowed the identification of the cytosolic proteases puromycin-sensitive aminopeptidase and bleomycin hydrolase, that are probably involved in N-terminal trimming of proteasomal digestion products and might play an important role in the generation of MHC class I-ligands.