Potenzierung der Suizidgen-Wirkung durch VP22-Fusionsproteine

Abstract

Die Suizidgen-Therapie versucht Tumorzellen, in die Selbstmord-gene wie Cytosin-Desaminase (CD) aus E. coli oder Thymidin-Kinase (TK) aus Herpes simplex-Virus (HSV-1) eingebracht wurden, spezifisch abzutöten, ohne das umgebende Gewebe zu schädigen. In vivo ist die Gentransfer-Effizienz jedoch zu gering, um wirksame Mengen der Selbstmord-Proteine zu bilden, so dass Tumore bislang nicht eliminiert werden konnten. Das HSV-1 Protein VP22 kann Proteine aus einer Produzenten-zelle in bis zu 500 Nachbarzellen transportieren, so dass die Zahl der erreichten Zellen durch VP22-Transport (spread) entscheidend vergrößert wird. Durch Quantifizierung des spread eines VP22-GFP-Fusionsproteins in 15 Säugerzelllinien mittels FACS wurde zunächst gezeigt, dass es sich beim VP22-vermittelten inter-zellulären Proteintransport um ein generelles biologisches Phänomen handelt. Darauf aufbauend wurde die Wirkungssteigerung in N- und C-ter-mi-na-len Fusionen der Suizidgene CD und TK mit VP22 in adenoviralen Vektoren überprüft. Nach Transfektion von Expressionsplasmiden ergab sich, dass TK-Fusionskonstrukte mit VP22 in beiden Verknüpfungen exzellenten Proteintransport aufwiesen, während CD sich nur als CD-VP22-Fusion transportieren ließ. Mittels Immunfluoreszenzfärbung wurde gezeigt, dass VP22-vermittelter spread auch bei Verwendung adenoviraler Vektoren (Ad) stattfindet. Dabei wurde eine Wirkungssteigerung des Suizidgen-Effektes in vitro in Cytotoxizitäts-Tests nachgewiesen: nach Transduktion von MH3924a-Hepatomzellen mit Ad-CD-VP22 konnte die IC50 der prodrug 5-FC gegenüber herkömmlichem Ad-CD signifikant reduziert werden. Bei Verwendung des Suizidgens TK wurde zwar ein spread der VP22-Fusionsproteine nach adenoviraler Transduktion detektiert, was jedoch zu keiner Cytotoxizitäts-Steigerung führte. Eine mögliche VP22-spezifische CTL-Immunantwort gegen das VP22-Transportprotein wurde durch Datenbank-Analyse und Chrom-Freisetzungs-Tests ausgeschlossen.

Suicide gene therapy aims to specifically kill tumor cells with the help of suicide genes like E. coli cytosine deaminase (CD) or Herpes simplex virus (HSV-1) thymidine kinase (TK), without harming the surrounding tissue. Nevertheless, when transducing suicide genes with viral vectors in vivo, the gene transfer efficiency is too low to produce an sufficient amount of suicide proteins to completely eliminate malignant tumors. The HSV-1 protein VP22 transports proteins from a producer cell in up to 500 neighboring cells, so that the number of genetically manipulated cells is profoundly improved by VP22 transport (spread). First, quantification of the spread of a VP22-GFP fusion protein in 15 mammalian cell lines via FACS analysis demonstrated that VP22-based intercellular protein transport is a general biological phenomenon. Next, constructing N- and C-terminal fusions of the suicide genes CD and TK with VP22, the improvement in tumor cell cytotoxicty was evaluated using adenoviral vectors (Ad). Transfection of expression plasmids resulted in excellent protein transport of TK with VP22 in both fusion directions, whereas in the case of CD fusions only the N-terminal CD-VP22 construct could be transported. For the first time adenoviral vectors were used to establish VP22-mediated spread as demonstated by immunofluorescence studies. Importantly, an increase in suicide efficiency was detected in vitro by SRB cytotoxicity assays: the IC50 of MH3924a hepatoma cells transduced with Ad-CD-VP22 was significantly reduced compared to conventional Ad-CD. However, no increase in TK cytotoxicity was found using VP22 fusion proteins in recombinant adenoviruses. Lastly, possible VP22-specific CTL immune responses against the VP22 transport protein were excluded by data base analysis and chrome release assays.