Untersuchungen zur Aktivität natürlicher Killerzellen gegenüber Zytomegalievirus-infizierten Targetzellen: Zytotoxizität in Hinblick auf die Expression von Oberflächenmolekülen

Abstract

Hinsichtlich der nach allogener Stammzelltransplantation zu einem frühen Zeitpunkt auftretenden hCMV-Erkrankungen (Median am Tag 25,5) bei gleichzeitig beobachteter deutlich gesteigerter Populationsdichte an CD56+ NK-Zellen in der frühen Rekonstitutionsphase wurde die NK-Zell-Aktivität gegen hCMV-infizierte Fibroblasten untersucht.

Dabei wurde zunächst der von C. Korzeniewski und D. M. Callewaert ausgearbeitete kolorimetrische adhärente LDH-Zytotoxizitätsassay mit den von K. Bloomberg et al. beschriebenen und in dieser Arbeit für Fibroblasten etablierten adhärenten und non-adhärenten BATDA-release-Assays verglichen. Da infizierte Fibroblasten bei hoher Infektiositätsrate ihre Adhärenz verlieren, erwies sich der non-adhärente Zytotoxizitätstest in Hinblick auf eine konstante Zellzahl bei möglichst hochgradiger hCMV-Infektion als ideales Testverfahren für die nachfolgenden Studien.

Die zytotoxische Funktionalität angereicherter NK-Zellen gesunder Probanden gegen AD-169-infizierte Fibroblasten war gering und zeigte nach Effektorzellstimulation mit niedrigdosiertem IL-2 oder IL-15, dem Einsatz der ADCC mittels anti-hCMV-IgG (Cytoglobin 5 %) und der Kombination beider Verfahren einen deutlichen Anstieg. Im Vergleich hierzu war die NK-Zell-Aktivität bei 2/3 der untersuchten Patienten nach allogener Stammzelltransplantation gegen AD-169-infizierte Targetzellen signifikant erhöht und konnte ebenfalls durch die Inkubation mit anti-hCMV-IgG und/oder Zytokinstimulation gesteigert werden. Diese antivirale Eigenschaft korreliert mit der über PCR detektierten niedrigen Inzidenz an hCMV-DNAämie (29 % am Tag 100) bei den seit 1995 in unserer Abteilung transplantierten Patienten mit CD34+ angereicherten Stammzellpräparaten. Allerdings konnte bei 1/3 des untersuchten Patientenkollektivs keine signifikante NK-Zell-Zytotoxizität gegen AD-169-infizierte Fibroblasten gemessen werden.

Desweiteren wurden klinische Virusisolate nach Fibroblasteninfektion auf ihre NK-Suszeptibilität untersucht. Gegenüber nichtinfizierten Targetzellen wiesen NK-Zellen sowohl von Patienten nach allogener Stammzelltransplantation als auch von gesunden Probanden bei WT-S1-, WT-MR-, WT-GR1- und WT-GR2-infizierten HFF eine geringere lytische Aktivität auf, die selbst durch eine Zugabe von anti-hCMV-IgG oder eine Vorinkubation mit Interleukinen nicht gesteigert werden konnte. Lediglich eine Infektion der Targetzellen mit dem Virusisolat WT-GR3 resultierte in einer gesteigerten NK-Suszeptibilität im Vergleich zu nichtinfizierten Fibroblasten. Diese konnte durch eine Inkubation der Effektorzellen mit IL-2 oder IL-15, die Gabe von anti-hCMV-IgG und die kombinierte Anwendung von Interleukinen mit einer ADCC deutlich gesteigert werden.

Als Grund für die erhöhte NK-Zell-Aktivität konnte über qualitative kinetische durchflusszytometrische Untersuchungen und quantitative Analysen mittels Quifikit im Gegensatz zu den WT-S1-, WT-GR1- und WT-MR-infzierten Targetzellen eine deutlich stärkere Restriktion von MHC-Klasse 1-Komplexen auf der Zelloberfläche AD-169- und WT-GR3-infizierter Fibroblasten gemessen werden. Die beiden letztgenannten wiesen zusätzlich eine Expressionssteigerung der LFA-3-Moleküle auf. Eine Maskierung dieser CD58+-Moleküle verlieh den WT-GR3-infizierten HFF eine Resistenz gegen die NK-Zell-vermittelte Lyse. Weitere hCMV-vermittelte Veränderungen zur Umgehung des Immunsystems wie die gesteigerte Expression der HLA-G- und HLA-E-Moleküle und eine unveränderte Dichte der MICB-, ULBP1- und ULBP2-Moleküle konnten auf fast allen infizierten Fibroblasten nachgewiesen werden. Die durch nahezu alle Virusstämme vermittelte Hochregulierung an ICAM-1, MICA und ULBP-3 scheint nur einen geringen Einfluss auf die NK-Zellfunktion zu haben.

Somit kann folgendes Modell für die NK-Zell-Suszeptibilität der jeweiligen infizierten Targetzellen aufgestellt werden: Voraussetzung für eine effektive Lyse dürfte nach Literaturlage die Herunterregulierung der MHC-Klasse 1-Moleküle sein. Allerdings ist nach den vorliegenden Ergebnissen eine zusätzliche Hochregulierung von LFA-3 entscheidend. Die Expression einer hohen Anzahl an LFA-3-Molekülen scheint dabei eine mögliche Wirkung der untersuchten NKG2D-Liganden zu überbieten.

Neben einer genaueren Charakterisierung hCMV-infizierter Fibroblasten konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Gabe von klinischen Dosen an Interleukin-2, Interleukin-15 und/oder Cytoglobin 5 % bei gesunden Probanden und einigen Patienten nach allogener Stammzelltransplantation eine gesteigerte NK-Zell-Aktivität gegen Targetzellen hervorruft, die mit LFA-3-hochregulierenden Virusstämmen infiziert waren. Klinisch wäre somit neben der Gabe von antiviralen Substanzen auch der Einsatz immunmodulierender Agenzien in der Therapie bzw. Prophylaxe hCMV-bedingter Infektionen denkbar. Weiterführende Studien sollten den Nutzen dieser neuen therapeutischen Strategien klären.

In the Department of General Paediatrics, Haematology and Oncology at the University Children’s Hospital Tübingen, in cooperation with the Institute of Medical Virology and Epidemiology of Viral Diseases at the University of Tübingen, the NK cell activity against hCMV-infected fibroblasts was examined. This makes sense in regard to hCMV illnesses at an early time after allogeneic stem cell transplantation (Median on the day 25.5) with, at the same time observed clearly increased population density in CD56+ NK cells in the early phase of reconstitution.

Firstly the colorimetric adherent LDH cytotoxicity assay of C. Korzeniewski and D.M. Callewaert was compared with those described by K. Bloomberg et al. and in this work reestablished adherent and non-adherent BATDA release assays for fibroblasts. Due to the fact that high-grade infected fibroblasts lose their adherence, the non-adherent cytotoxicity assay turned out to be the ideal test procedure for the following studies in view of a steady cell number with high rates of hCMV infection.

The cytotoxic functionality of enriched NK cells of healthy test persons against fibroblasts infected with AD-169 was low and showed a considerable increase after effector cell stimulation with low-dose IL-2 or IL-15, ADCC mediated by anti-hCMV IgG (Cytoglobin 5 %) and the combination of both. In comparison to this, the non-stimulated NK cell activity in approximately two thirds of transplanted patients provoked distinct lysis of the target cells infected with AD-169 and could be additionally increased by the incubation with anti-hCMV IgG and/or cytokine stimulation. This anti-viral capacity correlates with the low incidence of hCMV-DNAemia detected by PCR (29 % on the day 100) on patients with transplantations of positively selected CD34+ stem cells in our department since 1955. However, the effector cells from the remaining third of the patients did not exert significant cytotoxicity against AD-169 infected target cells.

Furthermore, clinical virus isolates were examined for their NK-susceptibility after infection of fibroblasts. Compared with non-infected target cells, NK cells from transplanted patients as well as from healthy probands showed a lower lytic activity against WT-S1-, WT-MR-, WT-GR1- and WT-GR2-infected HFF. This lytic action could not be increased by addition of anti-hCMV IgG or by preincubation with cytokines. Solely, the target cell infection with the viral isolate WT-GR3 resulted in an augmented NK-susceptibility compared with non-infected fibroblasts. This could be increased by an incubation of the effector cells with IL-2 or IL-15, the use of ADCC mediated by anti-hCMV IgG and the combination of both.

A possible explanation for the raised NK cell activity might be a significantly stronger restriction of MHC class 1 molecules on the cell surface of AD-169- and WT-GR3-infected fibroblasts in contrast to WT-S1-, WT-GR1- and WT-MR-infected target cells. This was measured by qualitative kinetic flow cytometry investigations and quantitative analyses by using Quifikit. AD-169- and WT-GR3-infected fibroblasts, in addition, showed an increased expression of LFA-3 molecules. The masking of these CD58+ molecules conferred a resistance of NK cell-mediated lysis to WT-GR3-infected fibroblasts. Further hCMV-mediated alterations avoiding the immune system such as the increased expression of HLA-G and HLA-E molecules and an unchanged density of MICB, ULBP1 and ULBP2 molecules could be proven on almost all infected fibroblasts. The upregulation of ICAM-1, MICA and ULBP-3 provided by nearly all viral strains seems to have only a slight influence on the NK cell function.

Therefore the following model can be postulated for the NK cell susceptibility of the respective infected target cells: Precondition for an effective lysis is dependent on the downregulation of MHC class 1 molecules. According to the present results, an additional upregulation of LFA-3 is dominant. Besides, the expression of a high number of LFA-3 molecules seems to outbid a possible effect of the examined NKG2D ligands.

In addition to a more exact characterization of hCMV-infected fibroblasts, the present work pointed out that the administration of clinical doses of interleukin-2, interleukin-15 and/or Cytoglobin 5 % in healthy probands and some patients after allogeneic stem cell transplantation caused an increased NK cell activity against target cells which were infected with LFA-3-upregulated viral strains. In addition to the administration of anti-viral substances, the application of immune-modulating agents could be beneficial in the therapy or prophylaxis of hCMV infections. Ongoing studies have to clarify the use of these new therapeutic strategies.