Expression von Wundheilungs-assoziierten Proteinen durch Progenitorfibroblasten und terminal differenzierte Funktionsfibrozyten

Abstract

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass humane dermale Fibroblasten einzelner Differenzierungsstadien differenzielle Genaktivität und Proteinexpression aufweisen. Auch die epitheliale Keratinozytenzelllinie HaCaT wird in unterschiedlicher Weise durch die einzelnen Fibroblasten-/ Fibrozyten-Differenzierungsstadien beeinflusst. Die Differenzierungsstadien wurden unterteilt in potentiell mitotische Progenitorfibroblasten (MF II und MF III) sowie terminal differenzierte Funktionsfibrozyten (PMF). Die Unterschiede in der Expression konnten sowohl bei wundheilungsfördernden sowie bei für chronische Wunden wundheilungsverzögernden Proteinen, nämlich KGF (Keratinozyten-Wachstumsfaktor) und MMPs (Matrix-Metalloproteinasen) festgestellt werden. Die Expression der betreffenden Markergene wurde sowohl auf mRNA-Level (real-time RT-PCR) als auch auf Proteinniveau (ELISA, Western-Blot, Zymographie) analysiert. KGF wird während der Differenzierung dermaler Progenitorfibroblasten zu terminal differenzierten Fibrozyten drastisch hochreguliert, sodass der Schluss nahe liegt, die Expression früher Differenzierungsstadien sei lediglich eine Basalexpression, wohingegen PMF-Zellen für die funktionelle Expression d.h. für die Wachstumsförderung und Zytoprotektion der Keratinozyten notwendig seien. Im Falle der MMPs ergeben sich verschiedene Expressionsmuster. MMP-2 sowie MMP-10 werden stärker von postmitotischen Fibrozyten exprimiert, während MMP-3 von Progenitorfibroblasten stärker exprimiert wird als von Funktionsfibrozyten. Die mittels Zymographie ermittelte allgemeine Aktivität der MMPs steigt jedoch während der Differenzierung von Fibroblasten stetig an. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass Fibroblasten-/ Fibrozyten-Differenzierungsstadien unterschiedlich auf die Proteinexpression von HaCaT-Zellen wirken. So wurde die Expression des FGF-BP (FGF-Bindprotein) einzig nach Stimulation von HaCaT-Zellen durch PMF-konditionierte Überstände hochreguliert, was ebenfalls auf eine alleinige funktionelle KGF-Expression der PMF-Zellen hindeuten könnte. In Bezug auf die MMP-Expression von HaCaT-Zellen konnte gezeigt werden, dass die MMP-Expression und -aktivität dieser Epithelzellen in den meisten Fällen nach Inkubation mit PMF-konditionierten Überständen am höchsten ist. Eine Ausnahme hiervon scheint MMP-2 zu sein, welches am stärksten exprimiert wird, wenn die Zellen mit MF II-konditionierten Überständen behandelt werden. Bezüglich der MMP-Expression von HaCaT-Zellen konnte mit Ausnahme des MMP-2 eine steigende Aktivität und Expression beobachtet werden, je höher der Differenzierungsgrad der Fibroblasten war, mit deren Überstand die HaCaT-Zellen zuvor behandelt worden waren. Die Aktivierung der HaCaT-sezernierten MMPs erfolgte indirekt, d.h. nicht über die proteolytische Spaltung Fibroblasten- bzw. Fibrozyten-sezernierter MMPs. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass den einzelnen Differenzierungsstadien der Fibroblasten im komplizierten Gefüge der Wundheilung differentielle Rollen zukommen.

In the present thesis three differentiation types of human dermal fibroblasts as well as their influence on the epidermal keratinocyte cell line HaCaT have been analyzed. The fibroblast types were defined as potentially mitotically active progenitor fibroblasts (MF II and MF III) and terminally differentiated postmitotic fibrocytes (PMF). It could be shown, that the specific cell types differed with respect to the expression of several proteins important for wound healing process. Keratinocyte Growth Factor (KGF), a wound healing promoting factor is upregulated drastically during the differentiation of fibroblasts to fibrocytes. HaCaT cells treated with supernatants of either differentiation type presented an increased level of FGF-BP mRNA exclusively after treatment with PMF-conditioned medium. As FGF-BP promotes KGF function this factor is also important for wound healing. In contrast the overexpression of matrix metalloproteinases (MMPs) in chronic wounds is known to inhibit wound healing. In this thesis it could be shown that the general MMP activity and expression increases steadily with differentiation of fibroblasts to terminally differentiated fibrocytes. MMP-2 and MMP-10 were upregulated whereas MMP-3 turned out to be the only analyzed MMP which is downregulated in fibrocytes. Interestingly fibroblast/ fibrocyte differentiation types influenced the epithelial keratinocyte cell line HaCaT in different fasions to express MMPs. The general expression and activation of MMPs was upregulated after treatment of HaCaT cells with fibrocyte (PMF) supernatant in comparison to untreated or progenitor fibroblast treated HaCaT cells. MMP-2 could be shown to be downregulated in HaCaT cells after treatment with PMF supernatants. Therefore it can be concluded that differentiation subtypes of fibroblasts influence wound healing directly or indirectly in different fashion and are worthy to be analyzed more closely in future studies.