Exploring Inner Ear Models and Imaging Techniques: A Basis for Future Gene Therapy of Otoferlin-Related Deafness

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 31. Dezember 2026 !

Hearing is a complex sensory process in which sound waves are captured by the outer ear, amplified by the middle ear, and converted into electrical signals in the inner ear. This transduction occurs in the cochlea through specialized hair cells within the organ of Corti, which transform mechanical vibrations into neural impulses. These signals are then transmitted via the auditory nerve to central auditory structures. Accurate synaptic transmission from inner hair cells to spiral ganglion neurons is essential for the correct perception of sound intensity, frequency, and spatial localization, but especially for speech recognition. The hereditary hearing disorder DFNB9 is an autosomal recessive form of congenital, non-syndromic, sensorineural deafness caused by mutations in the OTOF gene. This gene encodes otoferlin, a key protein involved in synaptic exocytosis in inner hair cells. Depending on the nature and severity of the mutation, DFNB9 usually leads to either mild to moderate hearing loss with preserved speech understanding or to profound congenital deafness with complete loss of speech understanding. Current clinical therapy primarily relies on cochlear implants, which bypass the defective synaptic transmission by directly stimulating the auditory nerve electrically. Recently, early clinical studies in children affected by DFNB9 have shown that gene therapy approaches can restore hearing thresholds to normal levels. Despite these promising results, significant knowledge gaps remain regarding the pathophysiology of OTOF-associated hearing loss, particularly concerning outer hair cell function. Therefore, detailed phenotypic characterization of various Otof mouse models is essential for optimizing the safety and efficacy of future gene therapies in humans.

This doctoral thesis aims to comprehensively study a mouse model carrying the most prevalent OTOF mutation found in humans, p.Gln829Ter. The primary objective of this basic research is to thoroughly characterize the phenotype of this variant in order to define the optimal therapeutic time window and minimize potential side effects. Another focus of this work is the evaluation of alternative methods for the analysis of gene therapy-treated inner ears. While conventional whole mount preparations of the organ of Corti are commonly used for immunohistochemical analysis, they are technically demanding and often result in tissue loss. In this study, the tissue clearing method was systematically evaluated and adapted to the murine cochlea. Tissue clearing is a technique in which refractive index mismatches are equalized to minimize light scattering in intact tissue, thereby enabling deeper optical penetration. This approach enables three-dimensional visualization and quantification of otoferlin expression, in particular the integrity of the hair cells, after gene therapy without structurally compromising the tissue. The final part of this thesis investigates whether individuals affected by DFNB9 exhibit increased sensitivity to noise exposure. Since otoacoustic emissions are typically lost within the first two decades of life in DFNB9 patients, it is hypothesized that outer hair cells may be more vulnerable to acoustic stress due to the lack of synaptic activity. It is therefore crucial to investigate whether, due to the lack of efferent inhibition during noise exposure, outer hair cells lose function or if the cells themselves undergo degeneration. This question will be addressed through controlled noise trauma experiments in Otof mouse models, aiming to contribute to the development of more differentiated treatment strategies for individuals with DFNB9.

Hören ist ein komplexer sensorischer Prozess, bei dem Schallwellen über das Außenohr aufgenommen, im Mittelohr verstärkt und im Innenohr in elektrische Signale umgewandelt werden. In der Cochlea erfolgt diese Transduktion durch spezialisierte Haarzellen im Corti-Organ, die mechanische Schwingungen in neuronale Impulse umwandeln. Diese Signale werden über den Hörnerv an zentrale auditorische Strukturen weitergeleitet. Eine präzise synaptische Übertragung von inneren Haarzellen auf die Spiralganglionneurone ist essenziell für die korrekte Wahrnehmung von Lautstärke, Tonhöhe und Schallrichtung, aber vor allem für Sprachverstehen. Die hereditäre Hörstörung DFNB9 ist eine autosomal-rezessiv vererbte Form der angeborenen, nicht-syndromalen, sensorineuralen Taubheit und wird durch Mutationen im OTOF-Gen verursacht. Dieses Gen codiert für Otoferlin, ein Schlüsselprotein für die synaptische Exozytose in inneren Haarzellen. Je nach Art und Schwere der Mutation führt DFNB9 zumeist zu einem milden bis moderaten Hörverlust mit erhaltenem Sprachverstehen oder zu kompletter kongenitaler Taubheit mit vollkommenem Verlust des Sprachverstehens. Derzeit basiert die klinische Therapie hauptsächlich auf der Verwendung von Cochlea-Implantaten, welche die gestörte synaptische Übertragung umgehen und eine direkte elektrische Stimulation des Hörnervs ermöglichen. Kürzlich konnten in ersten klinischen Studien bei einigen DFNB9-betroffenen Kindern durch Gentherapie die Hörschwellen fast bis zum Niveau des normalen Hörens wiederhergestellt werden. Trotz dieser vielversprechenden Ergebnisse bestehen weiterhin erhebliche Wissenslücken hinsichtlich der Pathophysiologie OTOF-assoziierter Hörstörungen, insbesondere in Bezug auf die Funktion der äußeren Haarzellen. Daher ist eine detaillierte phänotypische Charakterisierung verschiedener Otof-Mausmodelle unerlässlich, um die Sicherheit und Wirksamkeit zukünftiger Gentherapien für den Menschen zu optimieren.

In der vorliegenden Doktorarbeit soll ein Mausmodell mit der beim Menschen am häufigsten vorkommenden OTOF Mutation, p.Gln829Ter, eingehend studiert werden. Ziel dieser grundlagenorientierten Arbeit ist es, den Phänotyp dieser Variante umfassend zu analysieren, um den optimalen Therapiezeitpunkt besser eingrenzen und potenzielle Nebenwirkungen vermeiden zu können. Ein weiterer Schwerpunkt liegt auf der Evaluierung alternativer Methoden zur Analyse gentherapierter Innenohren. Während die konventionelle Whole-Mount-Präparation des Corti-Organs häufig zur immunhistochemischen Auswertung herangezogen wird, ist sie mit erheblichem technischem Aufwand verbunden und kann zu Gewebeverlusten führen. In dieser Arbeit wurde die Methode des Gewebeklärens (Tissue Clearing) systematisch untersucht und an die murine Cochlea angepasst. Beim Tissue Clearing handelt es sich um ein Verfahren, bei dem refraktive Unterschiede ausgeglichen werden, um die Lichtstreuung in intaktem Gewebe zu minimieren und so eine tiefere optische Durchdringung zu ermöglichen. Die Methode wurde gezielt für die Anwendung an Innenohrpräparaten optimiert, um die dreidimensionale Visualisierung und Quantifizierung der Otoferlin-Expression bzw. der Integrität der Haarzellen nach Gentherapie ohne die strukturelle Zerstörung des Gewebes zu ermöglichen. Im abschließenden Teil der Arbeit wird der Frage nachgegangen, ob DFNB9-betroffene Individuen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Lärmexposition aufweisen. Da bekannt ist, dass otoakustische Emissionen bei DFNB9-Patient:innen in der Regel innerhalb der ersten zwei Lebensjahrzehnte verloren gehen, liegt die Hypothese nahe, dass äußere Haarzellen durch die fehlende synaptische Aktivität anfälliger gegenüber akustischem Stress sind. Dabei ist es von zentraler Bedeutung, zu klären, ob durch die fehlende efferente Inhibition während der Lärmexposition die äußeren Haarzellen ihre Funktion verlieren oder ob es zu einem tatsächlichen Zelltod dieser Haarzellen kommt. Mittels kontrollierter Lärmtrauma-Experimente an Otof-Mausmodellen wurde diese Fragestellung untersucht und somit ein Beitrag zur Entwicklung differenzierter Behandlungsstrategien für DFNB9-Betroffene geleistet.