Die Bedeutung eines CRISPR-Cas9 induzierten Knockouts von TGF-β1 und TGF-β2 in Gliomzellen in vitro

Abstract

In der vorliegenden Dissertation wurde die Bedeutung eines CRISPR/Cas9- induzierten Knockouts von TGF-β1 und TGF-β2 in murinen GL261-Gliomzellen untersucht. Ziel der Arbeit war es, die Auswirkungen dieser Knockouts auf das Tumorverhalten, insbesondere auf Zellproliferation, Migration, Invasion sowie die Produktion von Zytokinen und Chemokinen, zu analysieren. Die Methodik umfasste die Anwendung von CRISPR/Cas9, um spezifische Knockouts der TGF-β1- und TGF-β2-Gene in den Gliomzellen zu erzeugen. Diese Knockout-Zellen wurden durch PCR und Sanger-Sequenzierung validiert. Anschließend wurden in vitro Assays zur Zellproliferation, Migration und Invasion durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Zytokin- und Chemokinproduktion mittels eines Zytokin-Arrays untersucht. Die Knockout-Zellen wurden ferner durch lentivirales Labeling mit mCherry fluoreszenzmarkiert, um sie in weiteren Experimenten nutzen zu können. Unsere Arbeit zeigte, dass der Knockout von TGF-β1 und TGF-β2 signifikante Auswirkungen auf das Verhalten der Gliomzellen hatte. Sowohl die Proliferation als auch die Motilität und Invasivität der Knockout-Zellen waren im Vergleich zu den Kontrollzellen reduziert. Dabei traten deutliche Unterschiede zwischen den Einzel- und Doppel-Knockouts auf. Interessanterweise führte der Knockout auch zu einer veränderten Zytokinproduktion, insbesondere zu einer Reduktion proinflammatorischer und angiogener Zytokine, was darauf hindeutet, dass TGF- β eine zentrale Rolle bei der Regulation des Tumormikromilieus spielt. Der Knockout von TGF-β1 und TGF-β2 in murinen Gliomzellen führte zu einer signifikanten Reduktion der malignen Eigenschaften dieser Zellen. Sowohl die Proliferation als auch die Motilität und Invasionsfähigkeit der Knockout-Zellen waren im Vergleich zu den Kontrollzellen deutlich reduziert, wobei der Doppel- Knockout den größten Effekt zeigte. Dies unterstreicht die Bedeutung von TGF- β1 und TGF-β2 in der Tumorprogression und bietet einen potenziellen Ansatzpunkt für therapeutische Strategien, die auf die Inhibition dieser Zytokine 88 abzielen. Die veränderte Zytokinproduktion in den Knockout-Zellen legt zudem nahe, dass TGF-β auch eine zentrale Rolle bei der Tumor-Immunevasion und der Tumorangiogenese spielt. Zukünftige Studien könnten untersuchen, inwieweit eine pharmakologische Hemmung von TGF-β in Kombination mit anderen Therapieansätzen, wie Immuncheckpoint-Inhibitoren oder anti-angiogenen Medikamenten, die Behandlung von Gliomen verbessern könnte. Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Grundlagen für weitere Forschungsarbeiten, die das Potenzial von TGF- β-Inhibitoren in der Krebstherapie untersuchen.