Towards Mapping of EMS Mutagenized chill Lines as Identified in Forward Genetic Screen in Grass Model Brachypodium distachyon

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 20. Januar 2027 !

Plants are able to respond to increases in the carbon dioxide (CO2) concentration through stomatal closure, which also leads to an increase in water use efficiency. Grasses have been shown to display faster stomatal responses than eudicot counterparts, in large part due to the presence of functional subsidiary cells which operate in opposition to guard cells. The emerging grass model species Brachypodium distachyon has been shown to have a high level of evolutionary collinearity to important cereal crops widely consumed by humans worldwide. In an effort to gain further insight into the mechanisms by which CO2 mediates stomatal movements in grasses, an unbiased forward genetic screen was developed, utilizing a population of over 1000 individually stored EMS mutagenized Brachypodium distachyon lines in the M5 generation. This screen was conducted using an infra-red camera to screen plants after exposure to high CO2 to identify those with cooler leaf temperatures, which indicated a reduction in stomatal closure. Among isolated mutants, two have been shown to be the most promising of all lines screened, chill1 and chill15. Both lines have been shown to exhibit cooler canopy leaf temperatures than wildtype control Bd21-3 after exposure to increased CO2 concentrations. These chill lines also both show a strong impairment in stomatal closure induced by exposure to increased CO2 concentrations yet show a robust stomatal response to abscisic acid leading to stomatal closure. Through genetic and bioinformatic analyses, chill1 has been mapped to a protein kinase, Mitogen Activated Protein Kinase 5 (BdMPK5). In vitro analyses reveal that the chill1 variant of BdMPK5 leads to an impairment in CO2/bicarbonate sensing when brought together with the functional High Temperature 1 (HT1) protein kinase. Modeling predictions made by AlphaFold2 indicate that the mutant residue causing the chill1 phenotype may reside at the interface between BdMPK5 and BdHT1. As such it has been concluded that BdMPK5 may be a crucial signaling component involved in stomatal response to CO2 and is proposed to be a key component of the CO2 sensor in grass model Brachypodium distachyon. Meanwhile, chill15, which also displays a markedly lower temperature after exposure to increased CO2 also shows a strong impairment in CO2 mediated stomatal response while retaining a robust response to abscisic acid. Following genetic and bioinformatic analyses a compiled list of potential candidate genes has been created to isolate the causative mutation for the chill15 phenotype.

Pflanzen können auf einen Anstieg der atmosphärischen Kohlendioxidkonzentration (CO2) mit einem Schließen der Spaltöffnungen reagieren, was gleichzeitig zu einer Steigerung der Wassernutzungseffizienz führt. Es wurde gezeigt, dass Gräser auf beispielsweise Änderungen in der CO2-Konzentration eine schnellere stomatäre Reaktionen zeigen als andere eudikotyledone Taxa, was zum großen Teil auf das Vorhandensein funktioneller stomatärer Nebenzellen zurückzuführen ist, die eine entgegengesetzte Turgor-Antwort zu den Schließzellen vollziehen. Es wurde gezeigt, dass die Gras-Spezies Brachypodium distachyon ein hohes Maß an evolutionärer Kollinearität mit wichtigen Getreidepflanzen aufweist, die weltweit von Menschen konsumiert werden. Um weitere Einblicke in die Mechanismen zu gewinnen, wie die CO2 Stomata-Bewegungen in Gräsern vermittelt wird, wurde ein vorwärtsgerichtetes genetisches Screening entwickelt, bei dem eine Population von über 1000 einzelnen EMS-mutagenisierten Brachypodium distachyon Linien (M5-Generation) verwendet wurde. Dieses Screening wurde mit einer temperatursensitiven Infrarotkamera durchgeführt, um Mutanten zu identifizieren, die in Gegenwart einer erhöhten CO2 Konzentration, gegenüber dem Wildtyp eine kühlere Blatttemperaturen aufweisen, was auf eine Verringerung des Spaltöffnungsschlusses hindeutet. Von den isolierten Mutanten erwiesen sich zwei als die vielversprechendsten unter allen analysierten Linien: chill1 und chill15. Es wurde reproduziert, dass beide Linien kühlere Blatttemperaturen aufweisen als die Wildtyp-Kontrolle Bd21-3, nachdem sie erhöhten CO2-Konzentrationen ausgesetzt wurden. Andererseits zeigen beide chill Mutanten weiterhin eine starke stomatale Reaktion auf Abscisinsäure, ein Hormon, das ebenfalls zum Stomata-Verschluss vermittelt. Durch genetische und bioinformatische Analysen wurde chill1 einer Proteinkinase zugeordnet, der Mitogen Activated Protein Kinase 5 (BdMPK5). In vitro-Analysen zeigen, dass die chill1-Variante von BdMPK5 eine Beeinträchtigung der CO2-/Bikarbonat-Erkennung nach sich zieht, wenn sie mit der funktionellen Proteinkinase High Temperature 1 (HT1) zusammengebracht wird. Modellvorhersagen mit Hilfe von AlphaFold2 deuten darauf hin, dass die mutierte Aminosäure, die den chill1-Phänotyp verursacht, an der Interaktionsschnittstelle von BdMPK5 mit BdHT1 liegt. Daher wurde der Schluss gezogen, dass BdMPK5 eine entscheidende Signalkomponente sein könnte, die an der stomatalen Reaktion auf CO2 in Brachypodium beteiligt ist, und dass es sich vermutlich um eine Schlüsselkomponente des CO2-Sensors in diesem Grasmodell handelt. Die von chill 1 verschiedene chill15 Mutante hat nach Einwirkung von erhöhtem CO2 ebenfalls eine deutlich niedrigere Blatttemperatur, die sich ebenfalls auf eine starke Beeinträchtigung der CO2-vermittelten stomatären Reaktion zurückführen lässt. Die stomatäre Verschlussreaktion auf Abscisinsäure ist jedoch nicht beeinträchtigt. Nach genetischen und bioinformatischen Analysen wurde eine Liste potenzieller Kandidatengene erstellt, um die ursächliche Mutation für den chill15-Phänotyp einzugrenzen.