Insights into the Role of YgfB in β-Lactam Resistance and Beyond

Abstract

Infektionen mit multiresistenten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen stellen eine wachsende Bedrohung im post-antibiotischen Zeitalter dar. Um eine effektive Behandlung solcher Infektionen zu ermöglichen und möglicherweise neue Angriffspunkte für Medikamente zu identifizieren, ist ein besseres Verständnis und eine Charakterisierung der Mechanismen der Resistenzbildung bei P. aeruginosa erforderlich. Einer der wichtigsten Resistenzmechanismen bei P. aeruginosa ist die Überexpression der induzierbaren β-Laktamase AmpC. Das bisher nicht charakterisierte Protein YgfB wurde kürzlich als neuer Akteur im komplexen Netzwerk identifiziert, das zur AmpC-vermittelten Resistenz im AmpC-überexprimierenden, multiresistenten P. aeruginosa Stamm ID40 führt. Es wurde beschrieben, dass YgfB die Produktion der Amidase AmpDh3 unterdrückt, von der bekannt ist, bestimmte ampC-induzierende Produkte des Zellwandrecyclings abzubauen. Ein verminderter AmpDh3-Spiegel führt zu einer Anhäufung dieser Produkte und zur Induktion der ampC-kodierten β-Laktamase. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der YgfB-vermittelten Repression von ampDh3 aufgeklärt. YgfB interagiert direkt mit AlpA, einem Transkriptionsregulator von ampDh3, und verhindert, dass AlpA an seine Bindungsstelle am ampDh3-Promotor bindet. Dieser Effekt von YgfB ist nicht auf das Isolat ID40 beschränkt, sondern konnte auch bei anderen multiresistenten P. aeruginosa-Isolaten beobachtet werden. Des Weiteren kann die Expression des Gens alpA durch DNA-Schäden, welche durch das Fluorchinolon Ciprofloxacin verursacht werden, induziert werden. Erhöhte Level von AlpA führen zu einer Hochregulierung der ampDh3-Expression. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass YgfB durch Interaktion mit AlpA eine übermäßige Wirkung Ciprofloxacin-vermittelter DNA-Schädigung auf die AmpDh3-Produktion und damit auch auf additive Effekte einer Ciprofloxacin/β-Laktam-Kombination abschwächt. YgfB kommt nicht nur in P. aeruginosa, sondern auch in anderen γ-Proteobakterien, einschließlich vieler pathogener Arten vor. Das Vorkommen von AmpDh3 und AlpA ist dagegen auf P. aeruginosa und einige wenige andere Arten beschränkt. Um eine allgemeine Funktion von YgfB in γ-Proteobakterien zu identifizieren, wurden Transkriptom- und Interaktomanalysen in P. aeruginosa und Escherichia coli durchgeführt. Bislang wurden verschiedene Interaktionspartner von YgfB sowohl in P. aeruginosa als auch in E. coli gefunden. Protein-fragment complementation assays führten zu ersten Bestätigungen mehrerer Interaktionspartner, die an verschiedenen zellulären Funktionen beteiligt sind. Folglich kann postuliert werden, dass die primäre Funktion von YgfB in der Interaktion mit anderen Proteinen und der anschließenden Beeinflussung von zellulären Prozessen besteht, deren Folgen derzeit noch unbekannt sind. Eine Interaktion mit Proteinen, die zu einer Regulation der Transkription führt, wurde in E. coli nicht gefunden und scheint daher bei P. aeruginosa eher eine Ausnahme als die Regel zu sein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit Einblicke in einen neuen Akteur in der komplexen Regulation der AmpC-vermittelten β-Laktam-Resistenz von P. aeruginosa gibt. Es wird gezeigt, dass YgfB an der Schnittstelle zwischen Zellwand-Recycling und DNA-Schadensreaktion agiert. Des Weiteren interagiert YgfB wahrscheinlich mit einer Reihe anderer Proteine mit unterschiedlichen Funktionen. Dies könnte Rückschlüsse auf die Rolle von YgfB in anderen γ-Proteobakterien zulassen.

Infections with multi drug resistant (MDR) Pseudomonas aeruginosa strains are one of the emerging threats in the post-antibiotic age. To better treat such infections and to potentially identify new druggable targets, the mechanisms of how resistance emerges in P. aeruginosa need to be better understood and characterized. One of the most important resistance mechanisms for P. aeruginosa is overexpression of the inducible β-lactamase AmpC. The previously uncharacterized protein YgfB was recently identified to be a novel player in the complex network leading to AmpC-mediated resistance in the AmpC overexpressing, MDR P. aeruginosa strain ID40. YgfB was described to repress production of the amidase AmpDh3, which is known to degrade certain ampC-inducing cell wall recycling products. Reduced AmpDh3 levels results in accumulation of these cell wall products and in induction of the ampC encoded β-lactamase. In this work, the mechanism of the YgfB-mediated repression of ampDh3 was elucidated. YgfB interacts directly with AlpA, a transcriptional regulator of ampDh3, and prevents AlpA from binding to its binding site on the ampDh3 promoter. The effect of YgfB repressing ampDh3 and thereby mediating resistance is not limited to the isolate ID40 but could also be observed in other MDR P. aeruginosa isolates. Furthermore, the expression of alpA can be induced by DNA damage, mediated by the fluoroquinolone ciprofloxacin. Increased levels of AlpA lead to upregulation of ampDh3 expression. In this work it was shown that YgfB, by interacting with AlpA, attenuates an excessive effect of ciprofloxacin-mediated DNA damage on the AmpDh3 production and therefore also on additive effects of a ciprofloxacin/β-lactam antibiotic combination. YgfB is not only found in P. aeruginosa, but also other γ-proteobacteria, including many pathogenic species. AmpDh3 and AlpA are, however, limited mostly to P. aeruginosa. To identify a general function of YgfB in γ-proteobacteria, transcriptomic and interactomic analyses in P. aeruginosa and Escherichia coli were done. So far, various interaction partners of YgfB were found in both P. aeruginosa and E. coli. Protein-fragment complementation assays led to first validations of several interaction partners involved in diverse cellular functions. Consequently, it can be postulated that the primary function of YgfB may be its interaction with other proteins and the subsequent influence on cellular processes, the consequences of which are currently unknown. An interaction with proteins leading to transcriptional regulation was not found in E. coli and seems therefore to be an exception to P. aeruginosa rather than the rule. In summary, this work provides insights into a novel player in the complex regulation of AmpC-mediated β-lactam resistance in P. aeruginosa. Evidence is provided that YgfB functions at the intersection of cell wall recycling and the DNA damage response. Additionally, YgfB likely interacts with a set of other proteins with diverse functions and these functions might generalize to other γ-proteobacteria.