Concentration-Dependent PAH Degradation and Gene Expression in Marine Cycloclasticus spp.

Abstract

Der Eintrag von Verunreinigungen durch polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) in Ökosysteme der Meere erfolgt über mehrere Größenordnungen und der mikrobielle Abbau ist ein höchst relevanter und entscheidender Verminderungsprozess. Die Sanierung niedrig dosierter PAK Kontaminationen durch biologischen Abbau ist jedoch noch weitgehend unerforscht. In der vorgestellten Dissertation wurde die Wissenslücke bezüglich der PAK Abbauaktivität unter verschiedenen Schadstoffbelastungen mit einer Kombination aus prozessorientierter, numerischer Modellierung und Laborexperimenten untersucht und Fragen von der Dynamik biochemischer Pfade bis zur Gesamtreaktion von Umweltsystemen auf PAKs behandelt. In der ersten veröffentlichten Studie, die in dieser Arbeit vorgestellt wird, wurde ein prozessbasiertes numerisches Modell entwickelt. Biomassenwachstum und Naphthalenabbau wurden für Cycloclasticus spp. simuliert. Batch-Kulturen, die wiederholte Naphthalenimpulse in niedriger Dosierung erhielten, wurden mit der herkömmlich verwendeten einmaligen Hochdosis verglichen Vogel et al., 2023a. Die Ergebnisse zeigten, dass die Pulsfrequenz und die Dosierungskonzentration die Abbaueffizienz in den simulierten Experimenten erheblich beeinflussten. Folglich bestimmte die Löslichkeitskinetik den biologischen Abbau und das Biomassenwachstum, sodass die endgültige Biomassenkonzentration der PAK abbauenden Bakterien allein kein ausreichender Indikator für die Quantifizierung des aktiven biologischen Abbaus war. Darüber hinaus wurde die einmalige Gabe einer hohen Naphthalendosis schneller abgebaut als die wiederholte Gabe niedriger Naphthalendosen. Dies deutet darauf hin, dass die wiederholte Gabe einer niedrigen Naphthalendosis zu einer Anreicherung von PAKs in unberührten Umgebungen führen könnte. Auf diese Weise wurden die Wechselwirkungen zwischen dem gekoppelten Abbau von Schadstoffen in geringer Konzentration und mikrobiellen Wachstumsprozessen aufgeklärt, und die Ergebnisse könnten wichtige Auswirkungen auf das zukünftige biologische Sanierungsmanagement diffuser Ölverschmutzung in der Meeresumwelt haben. Für die Risikobewertung und die Überwachung der biologischen Sanierung ist die Kenntnis der in situ Abbauraten unerlässlich. Das Verhältnis von mRNA zu DNA funktioneller Gene, das sogenannte Transkript-zu-Gen-Verhältnis, könnte eine kultivierungsunabhängige Messung sein, um Abbauraten pro Zelle zu ermitteln – möglicherweise sogar als Hochdurchsatz Methode. Im Erfolgsfall würde eine solche Messung eine Methode zur Quantifizierung der in situ PAK Abbauraten liefern. Ziel der zweiten und dritten Studie war es daher, das Verständnis der Genexpression von Biomarkergenen unter verschiedenen PAK Belastungen zu verbessern. Dies könnte dazu beitragen, die Wirksamkeit der Bioremediation in Zukunft zu überwachen und vorherzusagen. Jedoch war es bisher nicht bekannt, ob die Transkription von PAK Biomarkergenen als Indikator für den aktiven PAK Abbau dienen könnte. Durch Verwendung von qPCR wurde im Modellstamms des PAK Abbauers Cycloclasticus pugetii strain PS-1 eine substratunabhängige Expression von drei wichtigen funktionellen Markergenen während des Abbaus von Naphthalen, Phenanthren, einer Kombination aus beiden, und Nicht-PAK-Kontrollen in hohen Konzentrationen (d. h. 200 mg L-1) festgestellt Vogel et al., 2023b. In anschließenden RNA Sequenzierungsexperimenten mit hohen und niedrigen Naphthalendosierungen (d. h. 100 und 30 mg L-1 wurde eine genetische Redundanz festgestellt, da 15 Gene, die für Enzyme kodieren, die am ersten Schritt des PAK Abbaus beteiligt sind, hoch transkribiert wurden. Bemerkenswerterweise wurden einige davon während des aktiven Naphthalenabbaus transkribiert, während andere bei Experimenten mit Naphthalenmangel transkibiert wurden. Darüber hinaus wurden einige Gene – darunter die drei funktionellen Markergene aus Vogel et al., 2023b – unabhängig vom verfügbaren Naphthalen substratunabhängig exprimiert Vogel et al., 2024. Daher wurden zwei unterschiedliche enzymatische Systeme für den Naphthalen Abbauweg vorgeschlagen: eines, bei dem die kodierenden Gene substratunabhängig transkribiert wurden, was zu einem „Hintergrund“ PAK Abbau führte, und ein zweites System, bei dem die kodierenden Gene als „Schnelle Reaktion“ auf das PAK transkribiert wurden. Diese hypothetische genetische Flexibilität könnte es hochspezialisierten PAK Abbauern wie Cyclcoalsticus spp. ermöglichen, sich bedarfsgerecht an veränderte PAK Dosierungen (also Konzentrationen) anzupassen. Letztendlich deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Transkription von PAK Markergenen nicht unbedingt mit der PAK Abbauaktivität korrespondiert und (Meta-)Transkriptionsdaten immer mit Vorsicht ausgewertet werden sollten. Zusammenfassend hat diese Arbeit unser Verständnis des konzentrationsabhängigen PAK Abbaus und der Genexpression in Ökosystemen des Meeres erheblich erweitert. Die hier vorgestellte Dissertation zeigt, wie ein interdisziplinärer Ansatz, der numerische Modellierung und nasslaborbasierte Studien umfasst, Wissenslücken schließen kann, die mit klassischeren Experimenten nur schwer zu untersuchen sind. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die bisher übersehenen Parameter der Dosierung und Häufigkeit von PAK Eintrag den biologischen Abbau auf mehreren Ebenen und damit das Problem von Schadstoffen in der Meeresumwelt stark beeinflussen können.

Input of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) contamination in marine ecosystems occurs over several orders of magnitude and microbial degradation is a relevant and arguably crucial attenuation process. However, the remediation of low-dosage PAH contaminations through biodegradation remains largely unstudied. In the presented thesis, the knowledge gap surrounding PAH-degradation activity under different contaminant loads was addressed with a combination of numerical modelling and laboratory experiments covering questions from the dynamics of biochemical pathways to the overall response of environmental systems. In the first published study presented in this thesis, a process-based numerical model was developed. Biomass growth and naphthalene degradation were simulated for Cycloclasticus spp. batch cultures receiving repeated low-dosage naphthalene pulses compared to the conventionally used one-time high-dosage Vogel et al., 2023a. The results showed that pulsing frequency and dosage concentration impacted the degradation efficiency in the simulated experiments considerably. In consequence, dissolution kinetics dictated biodegradation and biomass growth, making the final biomass concentration of PAH-degrading bacteria alone not a sufficient indicator for the quantification of active biodegradation. Furthermore, a one-time input of a high-naphthalene dose was degraded faster than repeated low dosages, implying that repeated low-dosage input could lead to PAH accumulation in exposed pristine environments. Thus, the interactions of coupled low-concentration pollutant degradation and microbial growth processes were elucidated and the results may have important implications for future bioremediation management of diffuse oil contamination in the marine environment. For risk assessment and bioremediation monitoring, knowledge of in situ degradation rates is imperative. The ratio of mRNA to DNA of functional genes, the professed transcript-to-gene ratio, could be a cultivation-independent, measurement to obtain per-cell degradation rates - potentially even in a high-throughput manner. If successful, such a measure would provide a method for quantifying in situ PAH-degradation rates. The second and third studies aimed, therefore, to understand expression of functional genes under various PAH loads, which might help to monitor and predict bioremediation efficiency in the future. It was, however, unknown if the transcription of PAH-degradation biomarker genes could serve as an indicator of active PAH degradation. Using the model PAH degrader Cycloclasticus pugetii strain PS-1, substrate-independent expression of three key functional marker genes was found during the degradation of naphthalene, phenanthrene, a combination of both, and no-PAH controls at high concentrations (i.e., 200 mg L-1) using qPCR Vogel et al., 2023b. In subsequent RNA-sequencing experiments with high and low naphthalene dosages (i.e., 100 and 30 mg L-1) genetic redundancy was detected as 15 genes encoding for enzymes involved in the initial step of PAH degradation were highly transcribed. Remarkably, some of these were transcribed during active naphthalene degradation, while others were expressed in naphthalene-starvation treatments. Additionally, some genes - including the three functional marker genes from Vogel et al., 2023b - were expressed substrate-independently, regardless of available naphthalene Vogel et al., 2024. Hence, two distinct enzymatic systems for the naphthalene-degradation pathway were proposed: one where the encoding genes were transcribed substrate-independently resulting in "background" PAH degradation, and a second system where the encoding genes were transcribed in response to the PAH enabling a "rapid response" following naphthalene exposure. This hypothesized genetic flexibility might allow highly specialized PAH degraders like Cycloclasticus spp. to adapt to changing PAH dosages (i.e., concentrations) in a need-based manner. Ultimately, the results imply that the transcription of PAH-marker genes does not necessarily correspond with PAH-degradation activity, and (meta-)transcription data should always be evaluated with caution. In summary, this work has greatly expanded our understanding of the dependence between PAH degradation (activity) and gene expression in marine environments. The presented thesis highlights how an interdisciplinary approach which includes numerical modelling and wet-lab-based studies can close knowledge gaps that are difficult to investigate with more classical experiments. The results show that the so-far-overlooked parameters of PAH dosage and frequency can highly influence biodegradation on multiple levels and, thereby, the fate of contaminants within marine environments.