Analysis of BMP and NAD Signalling during Zebrafish Embryogenesis

Abstract

Embryogenesis is a dynamic process during which a single fertilized cell develops into a multicellular organism, often with functional organs spatially arranged within the body. Across the animal kingdom, a conserved repertoire of signalling pathways orchestrates embryogenesis. How the molecular players of the signalling pathways function in a species-specific manner is yet to be investigated. Tackling this question involves a concerted effort of many developmental biologists. My part in this effort is to investigate the Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalling dynamics during dorsal-ventral patterning and how Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD) salvage pathway fine-tunes haematopoiesis during zebrafish embryonic development.

First, a BMP signalling gradient is involved in organising the dorsal-ventral axis of the zebrafish. There are five disparate models with different assumptions about how the BMP signalling gradient is established by a BMP-Chordin activator/inhibitor system with additional accessory proteins, namely, Tolloid, Sizzled, and Anti-dorsalizing morphogenetic protein (ADMP). In Chapter 1, I will discuss how we tested these models by quantifying the BMP signalling gradient upon loss-of-function of individual components and by measuring the biophysical properties of BMP, Chordin, and Sizzled fluorescent fusion constructs. Together, our data suggest that a graded source-sink mechanism underlies the BMP-Chordin system to shape the BMP signalling gradient during zebrafish gastrulation. Furthermore, Tolloid amplifies BMP signalling throughout the dorsal-ventral axis, while Sizzled restricts BMP signalling ventrally. In addition, admp overexpression affects BMP signalling in a concentration-dependent manner in zebrafish embryos: high levels of ADMP attenuate BMP signalling, whereas low levels of ADMP enhance BMP signalling. Thus, these extracellular components may refine the shape of the BMP signalling gradient, in addition to BMP inhibition by Chordin.

Second, it is currently unclear how the BMP-mediated body axis evolved in bilaterally symmetric organisms. Our collaborators found that in the anthozoa cnidarian, Nematostella vectensis, knockdown of a previously uncharacterised zinc finger protein with a SWIM domain (Zswim4-6) caused flattening of the BMP signalling gradient and incorrect endoderm compartmentalisation. Whether the zebrafish homologue Zswim5 has a conserved role in the axis formation of bilaterians such as the zebrafish is yet to be investigated. In Chapter 2, I present how Zswim5 may have a role in the development of distal structures along the dorsal-ventral axis, for example, eyes, blood, and tail. Similar to findings in Nematostella, overexpression of zswim5 in zebrafish embryos can flatten the BMP signalling gradient slope. This shallower BMP signalling gradient may have caused the developmental defects. Since homologous Zswims in Nematostella and zebrafish have a conserved role in BMP-mediated axis formation, this further supports that bilaterians and cnidarians could have a bilaterally symmetric common ancestor.

Finally, the ventral-most mesodermal cells that receive the highest BMP signalling will differentiate into blood cells. Recycling of NAD by the zebrafish nicotinamide phosphoribosyltransferase-a (Nampta) is essential for haematopoiesis and the viability of the embryo. However, there is a discrepancy in the reported phenotypes upon nampta loss-of-function. Therefore, in Chapter 3, I re-examine the role of Nampta during blood development by comparing two loss-of-function approaches: stable mutant knockout line using CRISPR/Cas9 and transient gene knockdown using morpholino. My findings suggest that the nampta morpholino has off-target effects and that Nampta provides robustness by supplying additional NAD to increase blood cell markers, but nampta loss-of-function does not affect zebrafish viability or abolish haematopoiesis.

Overall, this dissertation deepens our understanding of how key signalling pathways have evolved in a species-specific manner to fine-tune cellular differentiation during zebrafish embryogenesis. This is accomplished by first demonstrating how Chordin, Sizzled, Tolloid, and ADMP make up an extracellular network to shape the BMP signalling gradient for dorsal-ventral patterning. Second, an intracellular protein Zswim5 is likely a modulator of the BMP signalling gradient and is conserved in bilaterally symmetric organisms. Third, in later stages, NAD recycled by Nampta redundantly supports blood cell specification. I hope that these novel findings improve our understanding of zebrafish as an animal model for vertebrate development and highlight potential mechanisms to consider during animal embryogenesis.

Im gesamten Tierreich reguliert ein konserviertes Repertoire an Signalwegen die Embryogenese. Noch ist unklar, wie dieses Repertoire auf molekularer Ebene seine speziesspezifischen Funktionen erfüllt. Um diesen Prozess zu verstehen, bedarf es der konzertierten Anstrengung vieler Entwicklungsbiologen. Mein Teil dieser Bemühungen besteht darin, die Signaldynamik von Bone Morphogenetic Protein (BMP) während der dorsal-ventralen Strukturierung und außerdem die Feinabstimmung der Hämatopoese durch den Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD)-salvage-pathway während der Embryonalentwicklung des Zebrafisches zu untersuchen. Erstens analysiere ich den BMP-Signalgradienten, der die dorsal-ventrale Achse des Zebrafisches organisiert. Derzeit gibt es fünf unterschiedliche Modelle mit verschiedenen Annahmen über die biophysikalischen Eigenschaften des Aktivators BMP und seines Inhibitors Chordin die erklären wie der BMP Signalgradient, unter Mitwirkung der extrazellulären Proteine, nämlich – Sizzled, Tolloid und Anti-dorsalizing Morphogenetic Protein (ADMP), erzeugt wird. In Kapitel 1 werde ich diskutieren, wie wir diese Modelle getestet haben, indem wir den BMP Signalgradienten nach Ausschaltung/Funktionsverlust individueller Komponenten quantifiziert haben und die biophysikalischen Eigenschaften von BMP, Chordin und Sizzled gemessen haben. Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass dem BMP-Chordin-System ein graded source-sink Mechanismus zugrunde liegt, um den BMP-Signalgradienten während der Zebrafischgastrulation zu formen. Zusätzlich verstärkt Tolloid das BMP-Signal entlang der dorsal-ventralen Achse, während Sizzled das BMP-Signal ventral begrenzt. Darüber hinaus beeinflusst die Überexpression von ADMP die BMP-Signalübertragung in Zebrafischembryonen konzentrationsabhängig: Hohe ADMP-Werte dämpfen die BMP-Signalübertragung, während niedrige ADMP-Werte das BMP-Signal verstärken. Somit können diese extrazellulären Komponenten die Form des BMP-Signalgradienten zusätzlich zur BMP-Hemmung durch Chordin verfeinern. Zweitens ist derzeit unklar, wie sich die durch BMP-vermittelte Körperachse in bilateral symmetrischen Organismen entwickelt hat. Unsere Kollegen fanden heraus, dass beim Nesseltier Nematostella vectensis die gedämpfte Expression eines bisher nicht charakterisierten Zinkfingerproteins mit einer SWIM-Domäne (Zswim4-6) zu einer Abflachung des BMP-Signalgradienten und einer falschen Endoderm-Kompartimentierung führte. Ob das Zebrafisch-Homolog Zswim5 eine konservierte Rolle bei der Achsenbildung von Bilateria wie dem Zebrafisch spielt, muss noch untersucht werden. In Kapitel 2 erkläre ich, wie Zswim5 eine Rolle bei der Entwicklung distaler Strukturen entlang der dorsal-ventralen Achse spielen könnte. Ähnlich wie bei Nematostella kann eine Überexpression von Zswim5 in Zebrafischembryonen die Steigung des BMP-Signalgradienten abflachen. Meine Daten legen nahe, dass dieser flachere BMP-Signalgradient zu Entwicklungsstörungen führen könnte. Da homologe Zswims in Nematostella und Zebrafischen eine konservierte Rolle bei der BMP-vermittelten Achsenbildung spielen, unterstützt dies die Annahme, dass Bilateria und Cnidaria einen bilateral symmetrischen gemeinsamen Vorfahren gehabt haben könnten. Schließlich untersuche ich die ventralsten mesodermalen Zellen, die das höchste BMP-Signal empfangen und sich zu Blutzellen differenzieren. Das Recycling von NAD durch die Zebrafisch-Nikotinamid-Phosphoribosyltransferase-a (Nampta) ist für die Hämatopoese und die Lebensfähigkeit des Embryos von wesentlicher Bedeutung. Es besteht jedoch eine Diskrepanz in den publizierten Phänotypen bei einem Funktionsverlust von Nampta. Daher untersuche ich in Kapitel 3 erneut die Rolle von Nampta während der Blutentwicklung, indem ich zwei Ansätze zum Funktionsverlust vergleiche: eine stabile Mutanten-Knockout-Linie mit CRISPR/Cas9 und einen transienten Gen-Knockdown mit Morpholino. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass nampta-Morpholino hat Off-Target-Effekte und dass Nampta die Robustheit der Entwicklung fördert, indem es zusätzliches NAD zur Erhöhung von Blutzellmarkern bereitstellt, der Funktionsverlust von Nampta jedoch weder die Lebensfähigkeit von Zebrafischen beeinträchtigt noch die Hämatopoese unterbindet. Insgesamt vertieft diese Dissertation unser Verständnis darüber, wie sich wichtige Signalwege auf speziesspezifische Weise entwickelt haben, um die Zelldifferenzierung während der Embryogenese von Zebrafischen zu verfeinern. Zunächst wird gezeigt, wie Chordin, Sizzled, Tolloid und ADMP ein extrazelluläres Netzwerk bilden, um den BMP-Signalgradienten für die dorsal-ventrale Musterbildung zu formen. Zweitens erläutere ich, dass ein intrazelluläres Protein – Zswim5 – wahrscheinlich ein Modulator des BMP-Signalgradienten ist und in evolutionär weit entfernten, bilateral symmetrischen Organismen konserviert ist. Drittens wird gezeigt, dass das von Nampta recycelte NAD in späteren Phasen redundant die Blutzellspezifikation unterstützt. Ich hoffe, dass diese neuen Erkenntnisse unser Verständnis des Zebrafisches als Tiermodell für die Entwicklung von Wirbeltieren verbessern und mögliche Mechanismen, die bei der Embryogenese von Tieren zu berücksichtigen sind, aufzeigen.