Identification of Potential T cell Antigens for Small Cell Lung Cancer – Immunopeptidomics-based Target Identification and T cell Assay Optimization for Sensitive Detection of Antigen-specific T cells

Abstract

T cell-based immunotherapies such as peptide-based vaccines specifically activating or boosting vaccine induced T cell responses harbor great potential to fight cancer. Part I of this work presents a mass spectrometry-based immunopeptidomics approach for the identification of potential T cell antigens that could be targeted in small cell lung cancer (SCLC). High numbers of HLA class I and HLA class II peptides were extracted from SCLC tumor samples of fresh patient material (cryorecanalization or biopsy) and xenograft models. Comparative analysis with datasets of peptides presented on healthy tissues identified tumor-exclusive HLA class I and II peptides in SCLC that were shared by different tumor samples and originated from cancer- or SCLC-associated proteins, among other proteins. Most interesting HLA class I ligands were selected on a patient individual basis or with the intent to create a warehouse of frequently shared antigens. Interestingly we were able to identify one mutated neoantigen. Additionally, we performed exploratory immunopeptidomics of soluble HLA from plasma samples of SCLC patients and identified patient-exclusive peptides. A comprehensive mass spectrometry dataset was acquired that is available to address further questions, including the analysis of other tumor-antigens like microbial-derived antigens. Selected peptides will now be validated in T cell assays like recall experiments using PBMCs of SCLC patients that were collected throughout this thesis. Parts II and III of this work present two published articles of an optimized and further developed T cell assay that is based on the detection of activated β2-integrins to assess functional antigen-specific T cells. In the first article a protocol for simultaneous detection of activated β2-integrins on both CD4+ and CD8+ T cells was described using a conformation specific monoclonal antibody, clone m24. The combination with intracellular markers IFN‑γ, TNF, IL-2 and CD154 allowed sensitive identification of low frequency antigen-specific T cells. The second article presents a simplified version of this method combining the extracellular staining of cell surface activation induced markers CD137 and CD154 with activated β2‑integrins. Combinatorial gating of these extracellular markers allowed improved assessment of antigen-specific T cells by increasing the signal to noise ratio and highly correlated with production of intracellular cytokines IL-2, TNF or IFN-γ. These T cell assays can be used in recall experiments with PBMCs from SCLC patients for validation of SCLC-specific antigens.

Dissertation ist gesperrt bis 16. Juli 2026 !

T-Zell-basierte Immuntherapien, wie Peptid-Impfstoffe, die neue oder vorhandene T-Zell- Reaktionen induzieren oder verstärken, bergen großes Potenzial in der Krebsbekämpfung. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Analyse des Immunopeptidoms mittels Massenspektrometrie zur Identifikation potenzieller T-Zell Antigene im kleinzelligen Bronchialkarzinom (SCLC). Eine große Anzahl an HLA-Klasse I und II präsentierten Peptiden wurde aus SCLC-Tumorproben von frischem Patientenmaterial (Kryorekanalisation oder Biopsie) und von Xenograft-Modellen extrahiert. Durch eine vergleichende Analyse mit Datensätzen von Peptiden aus gesundem Gewebe konnten tumorexklusive HLA-Klasse I und II Peptide identifiziert werden, die in verschiedenen Tumorproben vorkamen und unter anderem von krebs- oder SCLC-assoziierten Proteinen abstammten. Interessante HLA-Klasse I-Liganden wurden, für einzelne Patienten oder mit der Absicht ein Warenhaus von häufig vorkommenden Antigenen zu erstellen, ausgewählt. Interessanterweise konnten wir ein mutiertes Neoantigen identifizieren. Zusätzlich analysierten wir das Immunopeptidom von löslichen HLA-Molekülen aus Plasmaproben und konnten SCLC plasmaexklusive Peptide identifizieren. Es wurde ein umfassender Massenspektrometrie-Datensatz gewonnen, der für die Beantwortung weiterer Fragen zur Verfügung steht, einschließlich der Analyse anderer Tumorantigene wie mikrobieller Antigene. Die ausgewählten Peptide werden nun anschließend in T-Zell-Tests validiert, z.B. mit Hilfe von PBMC-Proben der SCLC-Patienten, die im Rahmen dieser Arbeit gesammelt wurden. In den Teilen II und III dieser Arbeit werden zwei Veröffentlichungen eines optimierten und weiterentwickelten T-Zell-Test vorgestellt, der auf dem Nachweis aktivierter β2-Integrine zur Analyse funktioneller antigenspezifischer T-Zellen beruht. Im ersten Artikel wurde ein Protokoll zum gleichzeitigen Nachweis von aktivierten β2-Integrinen auf CD4+ und CD8+ T‑Zellen unter Verwendung eines konformationsspezifischen monoklonalen Antikörpers, Klon m24, beschrieben. Die Kombination mit den intrazellulären Markern IFN-γ, TNF, IL-2 und CD154 ermöglichte eine sensitive Identifizierung von niedrigfrequenten antigenspezifischen T‑Zellen. Im zweiten Artikel wurde eine vereinfachte Version dieser Methode vorgestellt, bei der die extrazelluläre Färbung der Aktivierungsmarker CD137 und CD154 in Kombination mit aktivierten β2-Integrinen verwendet wurde. Die kombinatorische Analyse dieser Marker verbesserte das Signal-Hintergrund-Verhältnis. Die extrazelluläre Färbung korrelierte mit der Produktion von intrazellulären Zytokine IL-2, TNF oder IFN-γ in antigenspezifischen T-Zellen. Diese T-Zell-Tests können zur Validierung von SCLC-spezifischen Antigenen in PBMC-Proben verwendet werden.