Inhaltszusammenfassung:
Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektoren (TALEs) spielen eine maßgebliche Rolle für die Virulenz verschiedener Xanthomonas-Arten, indem sie Suszeptibilitätsgene (S) des Wirts induzieren. Unsere Studie zielte darauf ab, den Mechanismus zu klären, durch welchen der TALE PthA4 aus Xanthomonas citri ssp. citri (Xcc) die Krankheit Zitruskrebs verursacht. Xcc ohne PthA4 zeigen ein reduziertes Wachstum in der Pflanze und lösen keine Krankheitssymptome aus. Bisherige Untersuchungen identifizierten das Citrus-Gen CsLOB1, ein Mitglied der Transkriptionsfaktor-Familie (TF) der Lateral Organ Boundary (LOB), als das entscheidende durch PthA4 aktivierte S-Gen. Denkbar ist, dass CsLOB1 die Krankheit durch Aktivierung oder Unterdrückung von Zielgenen auslöst. Ziel unseres Projektes war es daher, CsLOB1-regulierte Wirtsgene und deren Bindungsstellen zu identifizieren, um Aufschluss über den molekularen Mechanismus der Pathogenese durch CsLOB1-Zielgene zu erhalten. Durch die Kombination von RNA-seq- und ChIP-seq-Studien konnten wir rund 100 Zielgene identifizieren, von denen viele mit der Aufweichung/Degradation der Zellwand in Verbindung stehen. Wir identifizierten ein 15bp CsLOB1-Bindungsmotiv, das in-vitro über Electrophoretic Mobility-Shift-Assays (EMSA) und in-planta über Promoter-Reporter-Assays validiert wurde. Darüber hinaus identifizierte der Promoter-Reporter-Assay die Aktivierung des CsLOB1-Bindungsmotivs durch ein LOB-Homolog der Tomate, SlLOB1. SlLOB1 reguliert die Erweichung der Frucht und weist eine gewebespezifische Expression auf, was uns zu einer Untersuchung des nativen Expressionsprofils von CsLOB1 veranlasste. Auch CsLOB1 wird in reifen Früchten stark exprimiert, in anderen Geweben hingegen nicht. Darüber hinaus zeigten Massenspektrometriedaten einen erhöhten Glucose-, Fructose- und Mannosegehalt in der apoplastischen Flüssigkeit von Xcc-infizierten Blättern, was darauf hindeutet, dass Xcc das Reifungsprogramm der Früchte zur Produktion von Zuckern übernimmt. Um die Kohlenstoffquelle zu identifizieren, untersuchten wir transkriptomische Veränderungen in Xcc in-planta mit Hilfe von RNA-seq und beobachteten eine Hochregulierung von Genen, die mit der Verwertung von Xylan, einem Hemicellulose-Bestandteil der Pflanzenzellwand, in Verbindung stehen. Unsere Hypothese ist, dass PthA4 die Lockerung der Zellwand auslöst, indem es den Fruchterweichungsregulator CsLOB1 aktiviert, wodurch bakterielle Enzyme Zugang zu Xylan als Kohlenstoffquelle erhalten und dieses abbauen können. In Anbetracht der Tatsache, dass es weitere TALEs gibt, welche TFs aktivieren, die den Zellwandabbau einleiten und Krankheiten auslösen, deuten unsere Forschungsergebnisse auf eine neuartige Strategie der TALEs hin, den Zellwandauflockerungsmechanismus des Wirts auszunutzen, um zur Nährstoffgewinnung an Polysaccharide aus den Zellwänden zu gelangen.
Abstract:
Transcription activator-like effectors (TALEs) play a key role in the virulence of various Xanthomonas species by inducing host susceptibility (S) genes. Our study focused on elucidating the disease-promoting mechanism of the TALE PthA4 from Xanthomonas citri pv. citri (Xcc), responsible for citrus canker disease. Xcc lacking PthA4 exhibits significantly reduced growth in-planta and fails to induce disease symptoms. Previous research identified the citrus gene CsLOB1, a member of the lateral organ boundary (LOB) transcription factor (TF) family, as the key S gene activated by PthA4. It is conceivable that CsLOB1 promotes disease by activating or repressing host target genes. Consequently, our project aimed to identify CsLOB1-regulated host genes and its binding sites, giving insights into the molecular mechanism of disease promotion by CsLOB1 target genes. Combining RNA-seq and ChIP-seq studies, we identified ~100 target genes, many of which are associated with cell wall loosening/degradation. We identified a 15bp CsLOB1 binding motif which was validated in-vitro via electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and in-planta via promoter-reporter assays. Furthermore, the promoter-reporter assay identified the activation of CsLOB1 binding motif by a LOB homolog in tomato, SlLOB1. SlLOB1 is a regulator of fruit softening that exhibits tissue-specific expression, prompting us to investigate the native expression profile of CsLOB1. Similarly, CsLOB1 is highly expressed in mature fruits and not in other tissues. Additionally, mass spectrometry data showed that the apoplastic fluid obtained from Xcc-infected leaves had increased glucose, fructose and mannose content, suggesting that Xcc hijacked the fruit ripening program to produce sugars. To identify the carbon source, we studied transcriptomic changes in Xcc in-planta using RNA-seq and observed upregulation of genes linked to xylan utilisation, a hemicellulose component of plant cell wall. We hypothesise that PthA4 induces the host’s cell wall-loosening mechanism by activating the fruit softening regulator, CsLOB1, thereby enabling bacterial enzymes to access and degrade plant xylan as a carbon source. Given that there are other TALEs activating TFs that also induce cell wall degradation to promote disease, our research suggests a novel strategy of TALEs, hijacking the host’s cell wall-loosening mechanism to access cell wall polysaccharides for nutrient acquisition.
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