Rescue of Missplicing by CRISPR/SpCas9-Based Genome Editing Approaches Targeting Deep-Intronic Variants in ABCA4

Abstract

CRISPR/Cas-vermittelte Genom-Editierung stellt eine vielversprechende Technologie dar, mit der sich die meisten bekannten krankheitsverursachenden Mutationen, einschließlich tief-intronischer Varianten, korrigieren lassen. Pathogene tief-intronische Varianten stellen einen erheblichen Teil der krankheitsverursachenden Mutationen im Mutationsspektrum des ABCA4-Gens dar. Die molekularen Mechanismen, durch welche sie wirken, sind mit fehlerhaften pre-mRNA-Spleißprozessen verbunden, die schließlich zu fehlgespleißten ABCA4-Transkripten führen. Die isolierte ABCA4 c.5197-557G>T tief-intronische Variante führt zur Retention einer 188-bp intronischen Sequenz im reifen mRNA-Transkript. Durch die Etablierung von drei Standard-CRISPR/SpCas9-basierten Ansätzen und der neuartigen Enhanced-Deletion-SpCas9-Strategie konnte der Spleißdefekt, der durch die isolierte c.5197-557G>T verursacht wird, im Minigen-Assay in HEK293T-Zellen sowie in heterozygoten c.5197-557G>T-Zapfen-Photorezeptor-Vorläuferzellen erfolgreich korrigiert werden. Darüber hinaus wurde der neuartige Enhanced-Deletion-SpCas9-Ansatz in einem Minigen-Assay in HEK293T-Zellen zur Rettung von Fehlspleißen aufgrund der geclusterten tief-intronischen Varianten (c.5196+1013G>A, c.5196+1056G>A, c.5196+1134C>G, c.5196+1137G>A und c.5196+1216C>A) im Intron 30 von ABCA4 in ersten Experimenten angewendet. Insgesamt konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Spleißdefekte in ABCA4, welche durch tief-intronische Varianten verursacht werden, durch die Anwendung von Genom-Editierungs-Ansätzen erfolgreich behoben werden können. Darüber hinaus wurde ein neuartiges und vielversprechendes Editierungs-Tool (Enhanced-Deletion-SpCas9) etabliert und für die Rettung von isolierten und geclusterten tief-intronischen-Varianten optimiert.

Genome editing mediated by CRISPR/Cas molecules represent a promising technology applicable to the correction of most of the known disease-causing mutations, including pathogenic deep-intronic variants. Pathogenic deep-intronic variants represent a good portion of the disease causing mutations in the mutational spectrum of the ABCA4 gene. The molecular mechanisms through which they act is associated with faulty pre-mRNA splicing processes, eventually leading to abberant ABCA4 transcripts. The isolated ABCA4 c.5197-557G>T deep-intronic variants results in the retention of a 188-bp intronic sequence in the mature mRNA transcript. By establishing three standard CRISPR/SpCas9-based approaches and the novel Enhanced-Deletion SpCas9 approach, the splicing defect due to the isolated c.5197-557G>T was sucessufully corrected in minigene assay in HEK293T cells, as well as in heterozygous c.5197-557G>T cone photoreceptor precursor cells. Furthermore, the novel Enhanced-Deletion-SpCas9 approach was preliminarly applied in minigene assay in HEK293T cells for the rescue of missplicing due to the clustered deep-intronic variants (c.5196+1013G>A, c.5196+1056G>A, c.5196+1134C>G, c.5196+1137G>A and c.5196+1216C>A) in intron 30 of ABCA4. On the whole, this thesis showed for the first time the successull rescue of ABCA4-related splicing defects by implementing genome editing approaches. In addition, a novel and highly promising editing tool (Enhanced-Deletion-SpCas9) was established and optimized for the rescue of isolated and clustered deep-intronic variants.