Metabolic Survival Strategies of Fe(II) Oxidation Coupled to Nitrate Reduction in the Chemolithoautotrophic Enrichment Cultures

Abstract

Chemical and microbial iron (Fe) redox processes play important roles in changing the fate of many contaminants (e.g. arsenic, cadmium) and nutrients. Fe(II)-oxidizing bacteria (FeOB) are widespread in the environment, being able to utilize several different electron acceptors, including nitrate. Autotrophic nitrate-reducing FeOB can remove nitrate and fix carbon, which leads to the production of greenhouse gases, i.e. nitrous oxide and carbon dioxide. Nitrate-reducing FeOB have been found in various types of environments such as freshwater sediments and groundwater, where they can potentially contribute to the removal of nitrate. To date, the autotrophic growth of nitrate-reducing FeOB is poorly investigated. The most prominent model system to study these microbes are enrichment cultures, i.e. mixed microbial communities performing nitrate reduction coupled to Fe(II) oxidation (NRFeOx) via metabolic exchange within the community. For example, enrichment cultures KS and BP from freshwater sediment in Bremen, Germany and culture AG from groundwater in Altingen, Germany were reported as autotrophic nitrate-reducing FeOB enrichment cultures. The studies in chapter 2 and 3 provide evidence that individual species in the nitrate-reducing FeOB enrichment cultures KS and BP perform Fe(II) oxidation, denitrification, carbon fixation and oxidative phosphorylation, and further propose interspecies interaction in each enrichment culture. In chapter 3, we report the geochemistry, the community relative abundance, the existence, and activity of the microorganisms in the original sampling site of BP culture. In addition to these results, we compared and analyzed the taxonomic position of three, so far, unclassified Gallionellaceae spp., that dominate in all currently existing autotrophic nitrate-reducing FeOB enrichment cultures, KS, BP, and AG. In chapter 4, we further classified these Gallionellaceae spp. as representatives of novel candidate taxa and proposed Candidatus (Ca.) names, ‘Ca. Ferrigenium straubiae’ sp. nov., ‘Ca. Ferrigenium bremense’ sp. nov. and ‘Ca. Ferrigenium altingense’ sp. nov. for bacteria growing in cultures KS, BP, and AG, respectively. The mechanisms, ecology, and environmental implications of microbial anaerobic Fe(II) oxidation were discussed in chapter 5. Meta-omic (i.e., metagenomics, metatranscriptomics, and metaproteomics) analyses were applied to both cultures KS and BP. For culture KS, the meta-omic analyses demonstrated that Gallionellaceae sp. and Rhodanobacter sp. were the key players performing Fe(II) oxidation coupled to denitrification under anoxic autotrophic conditions. ‘Ca. Ferrigenium straubiae’ might oxidize Fe(II), fix CO2, perform partial denitrification and produce nitric oxide (NO). The Rhodanobacter sp. may use the organic carbon fixed by ‘Ca. Ferrigenium straubiae’ and help ‘Ca. Ferrigenium straubiae’ to further detoxify the NO. This indicates that ‘Ca. Ferrigenium straubiae’ and Rhodanobacter sp. in culture KS are interdependent. In culture BP, the dominant ‘Ca. Ferrigenium bremense’ might play a similar role as ‘Ca. Ferrigenium straubiae’. However, ‘Ca. Ferrigenium bremense’ only possess the genes encoding nitrite reductase (nirK/S) and nitric oxide reductase (norBC). Therefore, the initiation and completion of the denitrification pathway by this species would require cooperation with other community members, e.g. the Noviherbaspirillum sp. and Thiobacillus sp., which possess the missing denitrification genes. In theory, the Noviherbaspirillum sp. and Thiobacillus sp. in culture BP have the ability to proceed NRFeOx autotrophically, i.e. all genes and transcripts potentially involved in metal oxidation (e.g. cyc2 or mtoA), denitrification and carbon fixation (e.g. rbcL) were detected. In addition to NRFeOx, the detection of the transcripts and partial proteins of cbb3- and aa3-type cytochrome c in both enrichment culture KS and BP, suggest that ‘Ca. Ferrigenium straubiae’ and ‘Ca. Ferrigenium bremense’ have an adaptation for growing under microoxic conditions. In ‘Ca. Ferrigenium altingense’ (culture AG), the genes encoding cbb3- and aa3-type types cytochrome c were also detected. However, these three enrichment cultures KS, BP, and AG were grown under anoxic autotrophic conditions. We proposed the further experiments to provide the evidence for the microaerophilic lifestyle of these three Ca. Gallionellaceae spp. in chapter 6. As for the environmental relevance, ‘Ca. Ferrigenium bremense’ accounted for approximately 0.13% relative abundance in situ. The other flanking members in culture BP were also detected in situ except for the Noviherbaspirillum sp. Additionally, 36 distinct Gallionellaceae taxa were detected in situ, suggesting that the diversity of microorganisms affiliated to Gallionellaceae that can potentially contribute to NRFeOx might be even higher than currently known. Overall, the studies in this dissertation improve our understanding of the metabolic mechanism of microbial survival strategies of nitrate-reducing FeOB in the enrichment cultures and its original environment, and could serve as the foundation for the further studies of nitrate-reducing FeOB and for the application of nitrate-reducing FeOB for the decontamination of polluted environments.

Chemische und mikrobielle Eisen (Fe)-Redoxprozesse spielen eine wichtige Rolle zum Verbleib vieler Schadstoffe (z.B. Arsen, Cadmium) und Nährstoffe in der Umwelt. Fe(II)-oxidierende Bakterien (FeOB) sind in der Umwelt weit verbreitet und können mehrere verschiedene Elektronenakzeptoren, einschließlich Nitrat, nutzen. Autotrophe nitratreduzierende FeOB können Nitrat abbauen und Kohlenstoff fixieren, was zur Produktion von Treibhausgasen, z.B. Lachgas und Kohlenstoffdioxid, führt. Nitratreduzierende FeOB wurden in verschiedenen Gebieten wie Süßwassersedimenten und Grundwasser gefunden und als mögliche Behandlung für Nitratverunreinigungen in Aquiferen und Abwässern untersucht. Bis heute ist das autotrophe Wachstum von nitratreduzierenden FeOB nur wenig erforscht. Das prominenteste Modellsystem zur Untersuchung dieser Mikroben sind Anreicherungskulturen, d.h mikrobielle Gemeinschaften, die Nitratreduktion gekoppelt an die Fe(II)-Oxidation (NRFeOx) gemeinsam durchführen. Zum Beispiel wurden die Anreicherungskulturen KS und BP aus einem Süßwassersediment in Bremen, Deutschland, und die Kultur AG aus dem Grundwasser in Altingen, Deutschland, als autotrophe nitratreduzierende FeOB-Anreicherungskulturen berichtet. Die Studien in Kapitel 2 und 3 belegen die Fähigkeit zur Durchführung von Fe(II)-Oxidation, Denitrifikation, Kohlenstofffixierung und oxidativer Phosphorylierung in den einzelnen Spezies in den nitratreduzierenden FeOB-Anreicherungskulturen KS und BP, und deuten außerdem auf Interaktionen zwischen den Spezies jeder Anreicherungskultur hin. In Kapitel 3 berichten wir über die Geochemie, die relative Häufigkeit in der Gemeinschaft sowie über die Existenz und Aktivität der Mikroorganismen in der ursprünglichen Probenahmestelle der Kultur BP. Zusätzlich zu diesen Ergebnissen verglichen und analysierten wir die taxonomische Position von drei bisher nicht klassifizierten Gallionellaceae spp., die alle derzeit existierenden autotrophen nitratreduzierenden FeOB-Anreicherungskulturen, KS, BP und AG, dominieren. In Kapitel 4 haben wir diese Gallionellaceae spp. als Vertreter neuer Kandidatentaxa klassifiziert und die Candidatus (Ca.)-Namen "Candidatus Ferrigenium straubiae" sp. nov., "Candidatus Ferrigenium bremense" sp. nov. und "Candidatus Ferrigenium altingense" sp. nov. für die in den Kulturen KS, BP und AG wachsenden Bakterien vorgeschlagen. Die Mechanismen, Ökologie und Umweltauswirkungen der mikrobiellen anaeroben Fe(II)-Oxidation wurden in Kapitel 5 diskutiert. Die Metaomics-Analysen (d.h. Metagenomics, Metatranscriptomics und Metaproteomics) wurde auf die beiden Kulturen KS und BP angewendet. Für die Kultur KS zeigte die Metaomics-Analyse, dass Gallionellaceae sp. und Rhodanobacter sp. die Hauptakteure bei der Fe(II)-Oxidation in Verbindung mit Denitrifikation unter anoxischen autotrophen Bedingungen waren. 'Ca. Ferrigenium straubiae' könnte Fe(II) oxidieren, CO2 fixieren, eine partielle Denitrifikation durchführen und Stickstoffoxid (NO) produzieren. Rhodanobacter sp. könnte den von 'Ca. Ferrigenium straubiae' fixierten organischen Kohlenstoff nutzen und 'Ca. Ferrigenium straubiae' bei der weiteren Entgiftung des NO helfen. Dies deutet darauf hin, dass 'Ca. Ferrigenium straubiae' und Rhodanobacter sp. in der Kultur KS voneinander abhängig sind. In der Kultur BP könnte das dominante 'Ca. Ferrigenium bremense' eine ähnliche Rolle spielen wie 'Ca. Ferrigenium straubiae'. Jedoch besitzt 'Ca. Ferrigenium bremense' nur die Gene, die für Nitritreduktase (nirK/S) und Stickoxidreduktase (norBC) kodieren. Daher würde die Initiierung und Vervollständigung des Denitrifikationsweges durch diese Spezies die Zusammenarbeit mit anderen Mitgliedern der Gemeinschaft erfordern, z.B. mit Noviherbaspirillum sp. und Thiobacillus sp., die die fehlenden Denitrifikationsgene besitzen. Theoretisch haben die Noviherbaspirillum sp. und Thiobacillus sp. in der Kultur BP die Fähigkeit, die NRFeOx autotroph durchzuführen, d.h. es wurden alle Gene und Transkripte nachgewiesen, die potentiell an der Metalloxidation (z.B. cyc2 oder mtoA), Denitrifikation und Kohlenstofffixierung (z.B. rbcL) beteiligt sind. Der Nachweis der Transkripte und Teilproteine des cbb3- und aa3-Typs von Cytochrom c sowohl in der Anreicherungskultur KS als auch in BP lässt neben NRFeOx darauf schließen, dass 'Ca. Ferrigenium straubiae' und 'Ca. Ferrigenium bremense' eine Anpassung an das Wachstum unter mikrooxischen Bedingungen aufweisen könnten. In 'Ca. Ferrigenium altingense' (Kultur AG) wurden auch die Gene, die für die Cytochrom c-Typen cbb3 und aa3 kodieren, nachgewiesen. Die drei Anreicherungskulturen KS, BP und AG wurden jedoch unter anoxischen autotrophen Bedingungen kultiviert. In Kapitel 6 schlagen wir weitere Experimente mit den drei Candidatus Gallionellaceae spp. vor, die ihre Fähigkeit zur mikroaerophilen Lebensweise untersuchen. Was die Umweltrelevanz betrifft, macht 'Ca. Ferrigenium bremense' 0,13 % der relativen Abundanz in situ aus. Die anderen flankierenden Mitglieder in der Kultur BP wurden mit Ausnahme von Noviherbaspirillum sp. auch in situ nachgewiesen. Darüber hinaus wurden 36 verschiedene Gallionellaceae-Taxa in situ nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die Vielfalt der mit Gallionellaceae verbundenen Mikroorganismen, die potenziell zu NRFeOx beitragen können, noch größer sein könnte als derzeit bekannt. Insgesamt haben die Untersuchungen in dieser Dissertation unser Verständnis des Stoffwechselmechanismus der mikrobiellen Überlebensstrategien von nitratreduzierenden FeOB in den Anreicherungskulturen und ihrer ursprünglichen Umgebung verbessert und könnten als Grundlage für den Einsatz von nitratreduzierenden FeOB zur Dekontamination verschmutzter Umgebungen dienen.