Inhaltszusammenfassung:
Bakterien besitzen Pathogenitätsmechanismen, um ihr eigenes Überleben zu sichern. Ein solches Pathogenitätsmechanismus ist das nadelähnliche Type III Sekretionsystem (T3SS). In den letzten Jahren wurden viele Methoden entwickelt, um T3SS sezernierte oder injizierte Proteine zu detektieren. Jedoch ist keine dieser Methoden einfach, schnell und unkompliziert, um ausreichend direkte Aussagen über die Quantität der Proteine zu treffen oder Kinetiken messen zu können. Dabei würde ein solcher Assay helfen, viele relevante biologische Fragen über das T3SS zu beantworten und auch hilfreich bei der Entdeckung von Inhibitoren gegen das T3SS sein. In dieser Arbeit präsentiere ich Methoden, die es uns erlauben, Proteine des T3SS i.) in der extracellulären Umgebung, ii.) in der Wirtszelle und iii) im Periplasma quantitativ und schnell zu detektieren. Dafür nutzte ich das von Promega neu entwickelte Reporterprotein NanoLuc (NLuc). Im ersten und zweiten Teil dieser Arbeit wurde NLuc an das sezernierte Effektorprotein SipA fusioniert, welches durch das T3SS in die extrazelluläre Umgebung und in die Wirtszelle transportiert wird. Der auf NLuc basierende Sekretions- und Injektionsassay bewies sich für das T3SS als sehr sensitiv und ermöglichte die Quantifizierung von SipA in verschiedenen Mutanten. Dieser neu etablierte Assay funktionierte bei Hochdurchsatzmessungen für die Entwicklung und Entdeckung von Inhibitoren als auch für Messungen der Kinetik, um die zeitliche Sekretion und Injektion zu beobachten.
Die Assemblierung des T3SS erfolgt schrittweise. Wenn der substratspezifische Wechsel durch das selbstgespaltene Schaltprotein SpaS induziert wird, wird der Aufbau des T3SS mit der Sekretion von Zwischensubstraten fortgesetzt. Die Regulation dieses Mechanismus ist unbekannt. Die Ausführung der Nadellängenkontrolle wird oft mit diesem Wechsel verbunden. Genetische Daten stellen dieses Modell jedoch in Frage und legen nahe, dass diese beiden Ereignisse unabhängig voneinander sind. Wir fragten uns, ob der Wechsel zu intermediären Substraten und späten Substraten unbedingt die vorherige Sezernierung der frühen Substrate erfordert. Um diese Frage zu klären, versuchten wir, einen Assay zu entwickeln, der die periplasmatische Sekretion in nadeldefizienten Mutanten detektiert. Dazu verwendeten wir die Split-Variante von NLuc. Das große Fragment von splitNLuc, LgBiT wurde als Komplementationspartner für die mit dem kleinen Fragment, HiBiT fusionierte T3SS Substrate ins Periplasma transloziert. Wir wurden mit verschiedenen Herausforderungen konfrontiert. Letztendlich haben wir alle Probleme überwunden und konnten den Assay erfolgreich in Proof-of-Concept-Experimenten einsetzen. Wir generierten auch die am besten geeigneten nadeldefekten Mutanten: Mit dem Assay und den Stämmen, die wir etabliert haben, wird es schließlich möglich sein, unser Verständnis des Prozesses vom substratspezifischen Wechsel zu vertiefen.
Abstract:
Bacteria have evolved different pathogenicity mechanisms to ensure their survival. One of them is the Type III Secretion System (T3SS). Salmonella employs the T3SS to secrete and inject effector proteins into the extracellular milieu and the host cell. Many methods have been established in the last few years to investigate the T3SS. However, none of these assays is sufficiently simple, quick or quantitative. Here, I present easy and rapid tools that allow detection of T3SS secreted proteins into the i.) extracellular environment; ii.) host cell and iii.) bacterial periplasm. The assays are based on the newly engineered luciferase NanoLuc (NLuc). NLuc proved to be a perfect reporter protein for T3SS proteins because of its high sensitivity and small size. In the first and second part of this thesis, the T3SS effector protein SipA served as fusion partner for NLuc to detect and quantify protein secretion in the extracellular environment and host cells. Thereafter, I could successfully extend the use of this system for high throughput screening to identify new T3SS inhibitors as well as to monitor real-time injection into host cells.
The assembly of the T3SS occurs in a stepwise manner. Once the basal body and cytoplasmic components are assembled, the secretion of early substrates starts. When substrate specificity switching is induced by the autocleaved switching protein SpaS, the assembly of T3SS proceeds with the secretion of intermediate substrates. The regulation of this switching mechanism is unknown. The execution of needle length control is often connected to the substrate specificity switching and is believed to regulate the switching. However, genetic data challenge this model and suggest that these two events are independent of each other. Therefore, we wondered whether switching to the intermediate substrates and late substrates strictly requires the prior secretion of early substrates. In order to address this question, we sought to develop an assay to monitor periplasmic secretion in needle deficient mutants. For this, we utilized the split variant of NLuc and targeted the large fragment of splitNLuc, LgBiT, to the periplasm as a complementation partner of T3SS substrates tagged with the small fragment of splitNLuc, HiBiT. Optimization of the assay required longer than expected as we faced different biological and technical challenges, e.g. in targeting LgBiT exclusively and stably to the periplasm and in detecting a specific luminescence signal in the periplasmic compartment. Eventually, we overcame all issues and were able to successfully use the assay in proof-of-concept experiments. We also generated the most suitable needle deficient mutants: With the tool and strains we established, it will finally be possible to deepen our understanding of the process of substrate specificity switching.
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