Inhaltszusammenfassung:
Zu den Erregern der Malaria des Menschen gehören Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale curtisi, P. ovale wallikeri und P. knowlesi. Darüber hinaus können zoonotische Malariaparasiten wie P. brasilianum, P. cynomolgi und P. simium unter experimentellen und natürlichen Bedingungen auch Menschen infizieren. Die Verbreitungsgebiete dieser Parasitenarten überschneiden sich und koexistieren in vielen endemischen Gebieten, was zu Ko-Infektionen führt. Der morphologische Nachweis mittels Lichtmikroskopie gelingt nur bei vergleichsweise vielen Parasiten im Blut und kryptische Spezies mit niedriger Parasitämie können von den dominierenden Parasiten oft nicht unterschieden werden. Dadurch wird die Prävalenz und Verteilung von Ko-Infektionen vor allem der weniger virulenten Plasmodium-Arten häufig stark unterschätzt. Die Aufdeckung solch komplexer Infektionen erfordert hochempfindliche molekulare Techniken, um valide epidemiologische Daten zu erhalten und erfolgreiche Interventionsstrategien zur Malariakontrolle und -beseitigung zu entwickeln.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden innovative diagnostische Technologien entwickelt und angewendet, um drei Problembereiche anzugehen, die nach wie vor eine große Herausforderung in der konventionellen Malariadiagnostik darstellen. Zunächst wurde ein auf Metagenomik-Sequenzierung basierender Ansatz entwickelt, um das Ausmaß von Ko-Infektionen verschiedener Plasmodium-Arten bei Patienten aus Gabun, Zentralafrika, zu untersuchen. Mit diesem Ansatz wurde eine unerwartet hohe Diversität von Plasmodium-Arten und Genotypen bei natürlich erworbenen Infektionen gefunden. Ko-Infektionen mit kryptischen Arten, darunter die kürzlich identifizierten sympatrischen Unterarten P. ovale curtisi und P. ovale wallikeri, wurden bei einer großen Zahl von Patienten mit unkomplizierter Malaria gefunden.
Zweitens wurde eine molekulardiagnostische Methode entwickelt, mit der die Übertragung von Plasmodien nicht-menschlicher Primatenarten Südamerikas– genannt P. brasilianum–auf den Menschen in den Yanomami-Gemeinschaften des venezolanischen Amazonasgebietes untersucht werden konnte. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse konnte zum ersten Mal systematisch gezeigt werden, dass die quartanen Malariaparasiten P. brasilianum und P. malariae identisch sind und quartane Malaria damit eine echte Anthropozoonose ist, die sowohl den Menschen als auch die Neuweltaffen infiziert.
Drittens wurde ein einfacher molekularer Test zur Detektion von Infektionen mit P. falciparum Parasiten entwickelt. Ein Hauptkriterium bei der Entwicklung des Tests war die verbesserte Sensitivität gegenüber der Mikroskopie. Der Test, der auf der Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) basiert, ist hochempfindlich, schnell und einfach zu implementieren und macht komplexe Instrumente überflüssig, weshalb er auch unter einfachen Bedingungen und mobil angewendet werden kann. Die Sensitivität ist bis zu 1000-mal besser als die konventionelle Malariadiagnostik (Mikroskopie und Schnelltest) und vergleichbar mit der ultra-sensitiven quantitativen PCR (RT-qPCR) bei einer diagnostischen Genauigkeit von 95%. Darüber hinaus zeigen die Daten, dass der Assay mit unverarbeitetem Blut für den schnellen Nachweis von P. falciparum funktioniert, d.h. ohne einen Nukleinsäure-Reinigungsschritt.
Diese Arbeit stellt Instrumente bereit, die eine genaue Diagnose und Fallidentifizierung von Individuen mit asymptomatischen Plasmodium-Infektionen geringer Dichte erleichtern. Mit Hilfe der entwickelten Methoden konnten expemplarische Studien zu aktuellen und wichtigen Fragestellungen der Malariologie durchgeführt werden. So konnten erstmalig Koinfektionen tertianer Malariaparasiten in Gabon nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte zum ersten Mal der molekularbiologische Beweis erbracht werden, dass quartane Malaria eine echte Anthropozoonose ist. Die Anwendung dieser innovativen diagnostischen Methoden kann entscheidend zur Verbesserung aktueller Interventionsstrategien zur Bekämpfung der tropischen Malaria in endemischen Gebieten beitragen.
Abstract:
The causative agents of human malaria include Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale curtisi, P. ovale wallikeri, and P. knowlesi. In addition, zoonotic malaria parasites such as P. brasilianum, P. cynomolgi, and P. simium can also infect humans under experimental and natural conditions. The distributions of these parasite species are overlapping and coexist in many endemic areas leading to mixed-species malaria infections. The morphology-based diagnosis using light microscopy has a low detection threshold and often fails to differentiate cryptic species from the major ones; thereby, prevalence and distribution of co-infection and less virulent species are often vastly underestimated. Unveiling such complex infections requires highly sensitive molecular techniques to obtain accurate epidemiological data to support malaria control and elimination intervention strategies.
As part of this thesis, innovative diagnostic technologies have been developed and utilized to address three challenges that are still major gaps and opportunities in conventional diagnostics for malaria. First, a metagenomics sequencing-based approach was developed to understand the level of Plasmodium species co-infections in patients from Gabon, Central Africa. By this approach, a surprisingly high diversity of Plasmodium species and genotypes in naturally acquired infections was observed. Cryptic species including recently identified sympatric sub-species—P. ovale curtisi and P. ovale wallikeri—were found in a large proportion of co-infections in patients with uncomplicated malaria.
Second, a molecular diagnostic technique was developed to show for the first time that transmission of non-human primate species—termed P. brasilianum—occurs naturally among Yanomami communities of the Venezuelan Amazon. These findings substantiated that P. brasilianum and P. malariae are not only the same parasites species but a true anthropozoonosis that infects both human and new world monkey.
Third, a simple molecular test of low-density, submicroscopic P. falciparum malaria infections was developed in a format compatible with field application. The test, based on recombinase polymerase amplification (RPA), is highly sensitive, rapid and easy to implement eliminating the need for complex instrumentations. The sensitivity was up to 1000 times higher than conventional malaria diagnostics (microscopy and RDTs) and had a 95% diagnostic accuracy comparable to ultra-sensitive quantitative PCR (RT-qPCR). Furthermore, the data showed that the assay worked with unprocessed blood for the rapid detection of P. falciparum, i.e., without any nucleic acid purification step.
This thesis provides methods that facilitate the accurate diagnosis and case identification of individuals with low-density asymptomatic Plasmodium species infections. It enabled the conduct of exemplary studies on current and relevant topics. Such, the first molecular evidence for the coinfection of tertian ovale malaria parasites in Gabon could be delivered. Moreover, it could be proven for the first time that quartan malaria is a true anthropozoonosis. Coupling the newly developed innovative diagnostic method to the current intervention strategies in the field can empower malaria control and elimination efforts of tropical malaria in endemic areas.
Metagenomics
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