Lokalisationsmechanismen der ATPase des Virulenz-assoziierten Typ VI Sekretionssystems in Burkholderia thailandensis

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URI: http://hdl.handle.net/10900/102007
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-1020072
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-43386
Dokumentart: Dissertation
Date: 2020-07-01
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biologie
Advisor: Schwarz, Sandra (Dr.)
Day of Oral Examination: 2019-07-17
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
570 - Life sciences; biology
Keywords: Bakterien , Infektionskrankheit
Other Keywords: Burkholderia
Sekretionssysteme
License: Publishing license excluding print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Das Typ VI Sekretionssystem (T6SS) besteht aus einem in der Membran verankerten kontraktilen zytoplasmatischen Tubus, der eine Nadel in Nachbarzellen treibt um toxische Effektoren zu sekretieren. Der kontrahierte Tubus wird von der AAA+ ATPase ClpV entfaltet und recycelt. Immer mehr Studien zeigen, dass die Lokalisation des T6SS in der Bakterienzelle von dem Typ der Zielzelle bedingt wird. T6SS, die gegen eukaryotische Zellen wirken, zeigen eine polare Lokalisation, wohingegen T6SS, die Bakterien angreifen, eine zufällige Lokalisation aufweisen. Wie die T6SS-Proteine den Assemblierungsort erreichen, ist jedoch unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es, mithilfe des Modellorganismus Burkholderia thailandensis erste Informationen über die grundlegenden Lokalisationsmechanismen der T6SS-Komponenten zu erlangen. B. thailandensis besitzt mehrere T6SS. Unter anderem das T6SS-1, welches Effektoren in andere Bakterien transloziert und das T6SS-5, ein essentieller Virulenzfaktor der Wirtszellen manipuliert. Vorausgegangene Arbeiten haben gezeigt, dass die ATPasen dieser beiden Sekretionssysteme, ClpV-1 und ClpV-5, diskrete Fokusse bilden, die eine zufällige bzw. polare Lokalisation aufweisen. ClpV-1-GFP-Fokusse weisen eine hohe Dynamik auf, die vermutlich den Abbau von kontrahierten Tubuli anzeigt. Im Gegensatz dazu sind ClpV-5-sfGFP-Fokusse statisch am Pol lokalisiert, was auf eine niedrigere Aktivität schließen lässt. Zunächst wurde die Rolle des T6SS-Apparates bei der Lokalisation von ClpV bestimmt. Dazu wurden B. thailandensis Mutanten mit vollständigen T6SS-1 und T6SS-5 Gencluster-Deletionen hergestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die diskrete, singuläre Fokusbildung von ClpV-1-GFP in der ∆T6SS-1-Mutante signifikant reduziert war, was bedeutet, dass ClpV-1 ohne T6SS-1-Proteine nicht lokalisieren kann. Im Gegensatz dazu lokalisiert ClpV-5-sfGFP auch in Abwesenheit der T6SS-5-Proteine am Pol. Das könnte bedeuten, dass es mit einem anderen Faktor interagiert, um zum Pol zu gelangen. Die Ergebnisse zeigen, dass die T6SS ATPasen unterschiedliche Informationen über die subzelluläre Lokalisation enthalten können. Weiterhin konnte die polare Lokalisation von ClpV-5 in der ∆T6SS-5 Mutante sowohl während der Infektion von Wirtszellen als auch außerhalb in Kulturmedium beobachtet werden. Ein intrazelluläres Signal der Wirtszelle ist daher nicht in Lokalisation von ClpV-5 involviert. Andere zytoplasmatische T6SS-5-Proteine wie TssK-5 und TssC-5 zeigten eine diffuse Verteilung in der ∆T6SS-5-Mutante. Die Beeinträchtigung von zellulären Faktoren, die in die räumliche Organisation von Bakterienzellen involviert sind, wie beispielsweise das Zytoskelettprotein MreB, hatte keinen Einfluss auf die Fokusbildung von ClpV-5 und ClpV-1. Da das T6SS ein kontaktabhängiges System ist und das Signal zur Kontraktion von T6SS-5 und T6SS-1 unbekannt ist, wurde der Einfluss von Oberflächenkontakt auf die Verteilung von ClpV-5 und ClpV-1 untersucht. Dafür wurden die Bakterien für unterschiedliche Zeitintervalle auf Agarosepads aufgetropft, um Oberflächenkontakt zu generieren. Als Kontrolle wurden die Bakterien in Flüssigkultur mit Paraformaldehyd fixiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Oberflächenkontakt nicht essentiell für die polare Lokalisation von ClpV-5 ist, diese aber induziert. Nach längerer Inkubation änderte sich die diffuse Verteilung von TssK-5-sfGFP zu diskreter Fokusbildung. Die Fokusse waren zufällig lokalisiert und scheinen unspezifisch zu sein. In B. thailandensis-Bakterien, die eine chromosomale clpV-1-gfp Fusion exprimierten und länger auf Agarosepads aufgetropft waren, konnte ein ClpV-1-GFP-Signal beobachtet werden. Die gleiche Mutante ohne Oberflächenkontakt zeigte kein GFP-Signal. Hieraus lässt sich schließen, dass Oberflächenkontakt ein Signal zur Expression von clpV-1 und vermutlich des gesamten T6SS-1-Genclusters darstellt. Zusammenfassend sind in dieser Arbeit neue Erkenntnisse zur Lokalisation von ClpV ATPasen von T6SS, die gegen Bakterien und Wirtszellen gerichtet sind, gewonnen worden.

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