Nachweis von funktionellen Antikörpern gegen den muskarinischen Acetylcholinrezeptor Typ 3 und Analyse ihres Einflusses auf die Rezeptoraktivität und Zellproliferation bei Patienten mit primär-biliärer Cholangitis in Abhängigkeit von Art und Dauer der Therapie

Abstract

Die PBC ist eine chronische cholestatische Lebererkrankung, deren Ursachen und Pathomechanismen noch nicht genau geklärt sind. Sie geht mit einer autoimmun bedingten Zerstörung der kleinen intrahepatischen Gallengänge einher und kann in fortgeschrittenen Stadien zu einer Schädigung des gesamten Leberparenchyms bis hin zum Vollbild einer Leberzirrhose führen (Kaplan 1996). Derzeitige Standardtherapie der PBC ist laut aktueller Leitlinie eine Dauertherapie mit UDCS (Strassburg et al. 2017). Aufgrund anderer assoziierter Autoimmunerkrankungen oder einer stattgehabten Lebertransplantation erhält jedoch ein Teil der PBC-Patienten zusätzlich zur UDCS-Therapie eine immunsuppressive Therapie. Bei über 90% der PBC-Patienten sind Autoantikörper gegen mitochondriale Antigene (AMA) nachweisbar, die sehr spezifisch für die Erkrankung sind und daher große diagnostische Bedeutung haben (Kaplan 1996). 2010 wiesen Berg et al. bei PBC-Patienten erstmals auch Antikörper gegen ein rekombinantes Peptid des muskarinischen Acetylcholinrezeptors Typ 3 (Anti-mAchR3- Antikörper) nach. Einige Studien haben gezeigt, dass solche Anti-mAchR3-Antikörper auch die Rezeptoraktivität beeinflussen können (Frischke 2013; Preuss et al. 2014a; Preuss et al. 2014b). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diese funktionelle und die Proliferation beeinflussende Aktivität der Anti-mAchR3-Antikörper bei PBC- Patienten zu re-evaluieren und Änderungen in der Aktivität und Prävalenz der Antikörper im Krankheitsverlauf unter verschiedenen Therapieregimen zu analysieren. Hierfür wurden Seren von 38 PBC-Patienten zum Zeitpunkt der Erstdiagnose bzw. vor Therapiebeginn und im Verlauf der Erkrankung (ohne Therapie, n = 4; unter Therapie mit UDCS, n = 18; unter immunsuppressiver Therapie, n = 16) untersucht. Um sicher zu sein, dass mögliche Effekte auf Antikörper und nicht andere Faktoren in den Patientenseren zurückzuführen sind, wurden aus allen Seren Immunglobuline durch Ammoniumsulfatfällung isoliert. Die Untersuchung der aus den Seren isolierten Immunglobulinfraktionen erfolgte mit einer in der Literatur vorbeschriebenen, teilweise leicht modifizierten Lumineszenz-basierten Methode. Hierbei wurden neben mAchR3- überexprimierenden CHO-Zellen auch Cholangiozyten (TFK-1-Zellen) und Hepatozyten (HEP-G2-Zellen) eingesetzt. Zudem wurde im selben Patientenkollektiv mittels eines 3H-Thymidin-basierten Proliferations-Assay auch die Prävalenz und Aktivität von die Zellproliferation beeinflussenden Antikörpern untersucht. Auch hier wurden entsprechende Verlaufsmessungen durchgeführt. Es konnte besonders mit TFK-1-Zellen und HEP-G2-Zellen eine hohe Prävalenz von rezeptorinhibierenden Anti-mAchR3-Antikörpern von 84% bzw. 63% festgestellt werden. Ein kleiner Prozentsatz der Anti-mAchR3-Antikörper (5% bei den TFK-1-Zellen, 3% bei den HEP-G2-Zellen) zeigte zudem rezeptoraktivierende Aktivität. Mit den CHO-Zellen gelang der Antikörper- Nachweis überraschenderweise trotz der Überexpression des Rezeptors weniger sensitiv. Bei 63% der Patienten ließen sich mit dieser Zelllinie keine funktionell aktiven Anti-mAchR3-Antikörper nachweisen, bei 26% inhibierende und bei 11% aktivierende Antikörper. Grund hierfür ist vermutlich eine Zell- bzw. Organspezifität der nachgewiesenen Anti-mAchR3-Antikörper, die beispielsweise auf zellspezifischen Subtypen des mAchR3 oder zellspezifischen Varianten der nachgeschalteten Signalwege beruhen könnte. Zudem scheint auch der Zustand der Zellen und das intrazelluläre Milieu Einfluss auf die Antikörperwirkung zu haben. Im Verlauf der Erkrankung ergaben sich bei den Messungen mit TFK-1-Zellen und HEP-G2-Zellen unter keiner der Therapieformen signifikante Veränderungen der Antikörper-Aktivität am mAchR3 oder wesentliche Veränderungen der Antikörper-Prävalenz. Bei den weniger sensitiven Messungen mit CHO-Zellen ergab sich lediglich in der Gruppe der immunsupprimierten Patienten im Verlauf eine statistisch signifikante Zunahme der rezeptorinhibierenden Aktivität der Anti-mAchR3-Antikörper, in den übrigen beiden Gruppen ließen sich auch mit den CHO-Zellen keine signifikanten Veränderungen feststellen. Analog zu den für die Erkrankung pathognomonischen AMA scheinen damit auch die funktionellen Anti-mAchR3- Antikörper im Krankheitsverlauf wenig Dynamik bezüglich ihrer Prävalenz und Aktivität zu zeigen. Im 3H-Thymidin-Proliferations-Assay konnte hauptsächlich eine die Proliferation inhibierende Antikörperwirkung auf HEP-G2-Zellen gezeigt werden. Diese Zellen wurden durch die Antikörperfraktionen aller untersuchten Patientenseren in ihrer Proliferation gehemmt. Mit TFK-1-Zellen und CHO-Zellen war deutlich seltener eine Proliferationshemmung zu beobachten (3% bzw. 16%). Ob diese ebenfalls sehr organ- bzw. zellspezifisch die Proliferation inhibierende Wirkung durch Anti-mAchR3-Antikörper oder andere Antikörper aus den Seren der PBC- Patienten verursacht wurde, musste in dieser Arbeit offen bleiben. Im Krankheitsverlauf zeigte die proliferationsbeeinflussende Aktivität der Antikörper bei keiner Zelllinie und keiner Patientengruppe eine signifikante Veränderung. Angesichts der starken Zellspezifität der nachgewiesenen Antikörper könnten künftige Studien an aus Biopsiematerial von PBC-Patienten gewonnen Cholangiozyten und Hepatozyten helfen, die mögliche pathogenetische Bedeutung der Antikörper besser zu verstehen. Diese Studien sollten nach Möglichkeit auch erneute Verlaufsmessungen beinhalten, um zu überprüfen, ob sich die hier gewonnenen Erkenntnisse an diesen Zellen bestätigen lassen.