Kombination von LiCl mit Hedgehog-Inhibitoren als neuer Ansatz für die Rhabdomyosarkom Therapie

Abstract

Rhabdomyosarkome (RMS) sind mit über 20% Anteil die häufigsten Weichteilsarkome im Kindesalter. Die Behandlung erfolgt primär durch eine chirurgische Resektion, kombiniert mit einer adjuvanten sowie neoadjuvanten Strahlen- und Chemotherapie. Vor allem bei metastasierten RMS ist die Prognose, trotz Kombinationstherapie, mit einer 10 Jahres Überlebensrate von 20% sehr schlecht. Dabei spielt die Entstehung von Resistenzen gegen Chemotherapeutika eine entscheidende Rolle und es werden dringend neue Behandlungsmöglichkeiten benötigt. Ein möglicher molekularer Angriffspunkt ist die Glykogensynthase-Kinase 3 (GSK-3). Diese Proteinkinase, die in viele Signalwege involviert ist, zeigt eine Beteiligung an der Entstehung und Progression zahlreicher Tumoren, so auch von RMS. Lithiumchlorid (LiCl) inhibiert, neben weiteren Enzymen, GSK-3. Die untersuchten RMS Zelllinien reagierten unter LiCl durchweg mit einem höheren Vitalitätsverlust als die SKMC. Auch wurde die Koloniebildungsfähigkeit durch LiCl eingeschränkt. Außerdem konnte LiCl in drei von vier RMS Zelllinien den Zelltod induzieren. Die LiCl Behandlung erhöhte dabei die GSK-3β-mRNA Expression, während die GLI1- mRNA Expression in drei der vier untersuchten RMS Zelllinien sank. Außerdem wurde LiCl in Kombination mit Hedgehog (Hh)-Inhibitoren getestet, da auch die Aktivität des Hh-Signalwegs mit der Malignität der RMS in Verbindung gebracht wird. Da darüber hinaus eine Interaktion von GSK-3 mit dem Hh-Signalweg bekannt ist, wurden mit der Kombination potentielle additive Effekte untersucht. Neben LiCl zur GSK-3-Inhibition wurden für die Hemmung des Hh-Signalwegs die Gli-Inhibitoren Arsentrioxid (ATO) und GANT61 sowie der SMO-Inhibitor Itraconazol verwendet. Die Kombinationen aus LiCl mit ATO bzw. GANT61 führte zu einem verstärkten Vitalitätsverlust und einer höheren Zelltodinduktion. Während die Vitalität unter beiden Kombinationen gleichwertig abnahm, zeigte sich die Kombination aus LiCl/ GANT61 bei der Zelltodinduktion überlegen. Die GSK-3β-mRNA Expression wurde durch die Inhibitorkombinationen, mit Ausnahme von LiCl/ GANT61, erhöht, während der Einfluss auf die GLI1-mRNA Expression unterschiedlich war. In RD und SRH Zellen senkten beide Inhibitorkombinationen die GLI1-mRNA Expression. In RH-30 und ZF Zellen stieg die GLI1-mRNA Expression nach GANT61 und LiCl Zugabe hingegen leicht an. Eine Dreifachkombination aus LiCl, ATO und Itraconazol konnte die Vitalität von zwei der vier RMS Zellllinien noch weiter senken. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die GSK-3-Inhibition durch LiCl ein möglicher Ansatz zur RMS Behandlung ist. Dabei kann durch die Kombination mit Hh-Inhibitoren eine Wirkungsverstärkung erzielt werden, was gleichzeitig Resistenzen vorbeugen und die Einzeldosen senken könnte. Um die Wechselwirkungen mit anderen Signalwegen zu verstehen, sind allerdings weitere Untersuchungen notwendig. Dass bis auf GANT61 alle verwendeten Inhibitoren in der Klinik zugelassen sind, könnte den Weg vom Tierversuch in eine klinische Studie verkürzen.

Rhabdomyosarcomas (RMS) are with 20% the most common pediatric soft tissue sarcomas. Treatment includes primary surgical resection, combined with adjuvant and neoadjuvant radiation and chemotherapy. Especially for patients with metastatic RMS, the prognosis is really poor with a long term survival rate of 20% despite a combination therapy. The emergence of resistance to chemotherapeutic agents plays a decisive role and new treatment options are urgently needed. A possible molecular target is Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3). This protein kinase which is involved in many signaling pathways, is implicated in the development and progression of many tumors, including RMS. Lithium chloride (LiCl) inhibits, besides other enzymes, GSK-3. Viability was generally reduced by LiCl in the examined RMS cell lines compared to SKMC. Also colony formation was compromised by LiCl. Moreover, LiCl induced cell death in three of the four RMS cell lines. This was accompanied by increased GSK-3β-mRNA expression, whereas GLI1-mRNA expression was reduced in three of the four RMS cell lines. In addition, LiCl was tested in combination with Hedgehog (Hh) inhibitors, because the activity of the Hh signaling pathway is also associated with the malignancy of RMS. Furthermore, an interaction of GSK-3 with the Hh signaling pathway is known, in order that the combination gives information about potential additive effects. In addition to LiCl for the GSK-3 inhibition, the GLI inhibitors arsenic trioxide (ATO) and GANT61 as well as the SMO inhibitor itraconazole were used for the inhibition of the Hh signaling pathway. The combination of LiCl with both ATO and GANT61 led to a further decrease of viability and a higher rate of cell death induction. GSK-3β-mRNA expression increased using both inhibitor combinations, whereas GLI1-mRNA expression was affected individually. In RD and SRH cells also both inhibitor combinations reduced GLI1- mRNA expression. However, in RH-30 and ZF cells GLI1-mRNA expression slightly increased by combined application of GANT61 and LiCl. A triple combination of LiCl, ATO and itraconazole was able to further reduce the vitality of two of the four RMS cell lines. The results of this work suggest that GSK-3 inhibition by LiCl is a possible approach for RMS treatment. The combination with Hh inhibitors may enhance the effect which could prevent resistances and may reduce single doses administered. However, further studies are needed to understand the crosstalk with other signaling pathways. That all inhibitors, with exception of GANT61, are already approved for clinical use, may accelerate progression to a clinical trial after animal testing.