Identifikation des HIV-Proteaseinhibitors Ritonavir als Medikament mit potentieller Wirksamkeit in der Therapie der Akuten Myeloischen Leukämie in Kombination mit Proteasominhibitoren

Abstract

Gegenstand dieser experimentellen Dissertation ist es, synergistische zytotoxische Effekte von Protease- und Proteasominhibitoren mit anderen Substanzgruppen und insbesondere mit bereits als Medikament verfügbaren Substanzen am Modell einer AML-Zelllinie sowie bei primären AML-Blasten zu identifizieren und zu charakterisieren. Mit Hilfe der von einem kovalent bindenden Proteasominhibitor abgeleiteten Affinitätssonde DansylAhx3L3VS (DALVS) werden in dieser Arbeit erstmals selektiv die aktiven Proteasomuntereinheiten in vitalen malignen humanen hämatopoetischen Zellen dargestellt. Die selektive Wirkung von Bortezomib auf die beta1/beta5 katalytischen Untereinheiten des Proteasoms konnten bestätigt werden. Da postuliert wurde, dass auch der HIV-Proteaseinhibitor Ritonavir eine Proteasom-inhibierende Aktivität hat (und dieses Medikament damit potentiell sehr interessant für die Therapie hämatologischer Neoplasien sein könnte), wurde der Effekt von Ritonavir auf AML-Zelllinien sowie primäre AML-Blasten mittels Affinitätsmarkierung untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Ritonavir in den klinisch relevanten Konzentrationen die Proliferation von AML-Zelllinien und primären humanen Blasten zwar hemmt, jedoch nicht über eine Proteasominhibition sondern vielmehr (ähnlich wie Bortezomib) zu einer der Proteasominhibition nachgeschalteten Aktivierung der Unfolded Protein Response (UPR) und ER-Stress führt, welcher für die Induktion von Apoptose verantwortlich ist. In Kombinationsversuchen konnte daraufhin gezeigt werden, dass Ritonavir und Bortezomib synergistisch das Wachstum der AML-Zelllinie THP-1 hemmen. Dieser Synergismus ließ sich bei einem von drei getesteten Proben von primären humanen AML-Blasten bestätigen. Andere in der derzeitigen Entwicklung befindliche potentielle Therapeutika für die AML (die Histondeacetylasehemmer Valproat, HDACi I und HDACi II und das Anthrazyklin-Zytostatikum Daunorubicin) zeigten keine synergistische Zytotoxizität in Kombination mit Ritonavir. Daunorubicin wirkte dagegen synergistisch mit Bortezomib. Diese Ergebnisse stehen nun für die weitere Entwicklung neuer onkologischer Therapiekonzepte und die Vorbereitung einer klinischen Testung zur Verfügung. Die Tatsache, dass es sich bei den drei synergistisch und mit unterschiedlichen Mechanismen wirkenden Stoffen (Bortezomib, Daunorubicin, Ritonavir) um bereits zugelassene Medikamente handelt, prädestiniert sie für zeitnahe klinische Studien außerhalb der kommerziellen Medikamentenentwicklung.

The aim of this experimental doctoral thesis was to characterize the synergistic cytotoxic effects of protease and proteasome inhibitors with other substance groups, in particular with already approved drugs, with an AML cell line (THP-1) as well as primary AML blasts serving as a model. Using the covalent proteasome label DansylAhx3L3VS (DALVS) in this work for the first time it was possible to visualize active proteasome subunits in vital malignant human hematopoietic cells. I could approve the selective effect of bortezomib on the beta1/beta5 catalytic proteasome subunits. Since it had been postulated that the HIV protease inhibitor ritonavir had a proteasome inhibitory activity as well, making it a potentially interesting drug for the treatment of hematological diseases, I tested its effect on the AML cell line and primary AML blasts using the DALVS labeling. I was able to show that ritonavir at clinically relevant concentrations inhibits the proliferation of the AML cell line as well as primary AML blasts, though this effect is not based on proteasome inhibition but further downstream on the activation of the unfolded protein response (UPR) leading to ER stress and thus apoptosis, similar to one of the mechanisms of action of bortezomib. With combination tests I could subsequently show that ritonavir und bortezomib synergistically inhibit the proliferation of the THP-1 AML cell line. This synergism could be confirmed with one of the three tested samples of primary human AML blasts. Other drugs being developed and potentially effective in treating AML (the histone deacetylase inhibitors valproate, HDACi I, and HDACi II, and the anthracycline cytostatic agent daunorubicin) did not show synergistic cytotoxicity in combination with ritonavir, while daunorubicin had a synergistic effect together with bortezomib. These results are now available for the further development of new oncological treatment concepts. The fact that those three substances being synergistically effective with different mechanisms of action (bortezomib, daunorubicin, ritonavir) are already approved drugs makes them ideal for prompt clinical trials outside the commercial drug development.