Untersuchungen zur adipogenen Wirkung von Insulin Detemir auf 3T3-L1-Präadipozyten

Abstract

Da bis heute eine Heilung der Volkskrankheit Diabetes nicht möglich ist, bleibt die Vermeidung der Folgeschäden durch normnahe Blutglukose in Folge Imitation einer möglichst physiologischen Insulinzufuhr oberstes Ziel. Insulin Detemir mit seinem langen Wirkprofil kann dies durch die Albuminbindung, der ein Myristinsäurerest zugrunde liegt, nahezu erreichen. In vielen Studien konnte inzwischen nachgewiesen werden, dass Detemir – im Vergleich zu herkömmlichen Insulinen - keinen Gewichtsanstieg hervorruft. Aus diesem Grund wurde die Wirkung des Insulin Detemir auf das wichtige Erfolgsorgan Fettgewebe anhand der Differenzierung von 3T3-L1-Präadipozyten auf drei Ebenen untersucht, jeweils versus Humaninsulin: die enzymatische Ebene mit der photometrisch bestimmten GPDH-Aktivität als Differenzierungsmarker; die morphologische mittels mikroskopischer Ansicht nach Färbung der Fetttröpfchen, sowie die Ebene der Genexpression, da während der Adipogenese mehr als 2000 Gene in ihrer Expression verändert werden; es wurden PPARG2 und Leptin als Differenzierungsmarker mittels Polymerase-Ketten-Reaktion quantifiziert. Da sich in den ersten Experimenten eine starke Differenzierungs-hemmung durch Serumalbumin zeigte, mussten alle Versuche in Abwesenheit von Albumin stattfinden. Bei supraphysiologischen Konzentrationen trat eine signifikant höhere Adipogenität des DET auf, was im Gegensatz zur Literatur und zur beobachteten Gewichtsneutralität steht. Ursächlich hierfür könnte die Wirkung des Fettsäurerestes bei hohen Konzentrationen sein. Ziel war es daher, die Untersuchungen mit möglichst physiologischen Insulinkonzentrationen durchzuführen, ein geeignetes Versuchsprotokoll wurde etabliert. Für die gleiche blutzuckersenkende Wirkung wird eine 4-fach molare Konzentration an Detemir benötigt, so dass die Ergebnisse im äquimolaren sowie im äquipotenten Bereich gewonnen wurden. Hier zeigte sich eine wesentlich weniger adipogene Wirkung des Detemir - äquimolar wie äquipotent - im Vergleich zu Humaninsulin; dass dies am Myristinsäurerest liegt, wurde in entsprechenden Kontrollen ausgeschlossen. Des Weiteren kann aufgrund der Proteinverläufe ein geringerer mitogener/zelltodsupprimierender Effekt von Detemir angenommen werden, da nur unter Humaninsulin postkonfluente Mitosen beobachtet wer-den konnten. Eine morphologisch vermutete weniger lipogene Wirkung wirft neue interessante Fragestellungen auf. Schließlich können die gewonnen Ergebnisse der geringeren Adipogenität Detemirs eine weitere gute Erklärung – erstmals auch auf molekularer Ebene - zum gewichtsneutralen Verhalten des Insulins darstellen.

As until now there is no possibility of healing the widespread disease diabetes, the prevention of secondary complications by reaching near normal blood glucose levels due to an insulin administration as physiological as possible, remains the ultimate ambition. Insulin detemir is nearly able to reach this due to its flat action profile caused by albumin binding based on a myristic acid moiety. By now, many studies have shown, that detemir – in comparison to traditional insulins – does not cause the expected weight gain. For this reason, the effect of insulin detemir on the important target organ adipose tissue was investigated by means of the differentiation process of 3T3-L1-preadipocytes. Three levels were explored, in each case compared to human insulin: the enzymatic level with the photometrically determined GPDH-activity as a marker for differentiation; the morphologic one by light microscopy after staining of the lipid droplets and, furthermore, the level of gene expression; during adipogenesis there are over 2000 regulated genes; in this study PPARG2 and leptin were quantified as markers for differentiation using polymerase chain reaction. As in preliminary experiments a strong differentiation inhibition due to albumin could be shown, all experiments had to be performed in the absence of albumin. In contrast to the expectations, to literature and the known weight neutrality, a significantly higher adipogenity of detemir emerged at supraphysiological concentrations. This could be due to the effect of the high concentration of the fatty acid moiety. Therefore, the aim was to perform the experiments at insulin concentrations as physiological as possible and an appropriate differentiation protocol has been established. For the same glucose-lowering effects as reached by human insulin, a four-fold molar concentration of detemir is needed; thus, the results were obtained at equimolar and equipotent concentrations. A less adipogenic effect of insulin detemir could be shown, equimolar as well as equipotent. One possible explanation – the myristic acid moiety – could be excluded in corresponding control experiments. On the basis of the protein course a less mitogenic/survival-promoting effect of insulin detemir could be proposed, as only in human insulin treated cells post-confluent mitoses were detected. A morphologically assumed also less lipogenic effect of detemir leads to new interesting questions. In conclusion, the obtained results of the less adipogenic effects of insulin detemir provide another reasonable explanation – for the first time on the molecular level – for the weight neutral properties of insulin detemir.