Aktivatoren und Signaltransduktion des HIF-1a-/VEGF-Signalweges in murinen dendritischen Zellen im Rahmen von Infektionen mit Yersinia enterocolitica

Abstract

DCs sind die aktivsten professionellen Antigen-präsentierenden Zellen. Sie fungieren im Rahmen einer Immunantwort als hauptsächliche Vermittler der Aktivierung naiver T-Zellen. Damit stellen sie das zentrale Bindeglied zwischen angeborener und adaptiver Immunität dar. Myeloische Zellen erwartet oft im Rahmen einer Entzündung in den infizierten Geweben ein Milieu mit reduziertem Sauerstoffgehalt. Um sich an diese Bedingungen adaptieren zu können, haben sie eine Überlebensstrategie entwickelt, welche die Beteiligung von HIF-1alpha erfordert. HIF-1alpha ist ein Transkriptionsfaktor, welcher unter hypoxischen Bedingungen in vielen Geweben induziert wird und die Aktivierung verschiedenster Gene reguliert, unter ihnen die Gene für VEGF. Es ist bekannt, dass dieser Signalweg auch unter normalen Sauerstoffpartialdruck durch bakterielle Bestandteile aktiviert wird. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Untersuchung, welche Rolle die TLR 2 und 4 sowie die Adaptermoleküle MyD88 und Trif im Rahmen einer Infektion von DCs mit Y. enterocolitica für die Aktivierung von HIF-1alpha und VEGF spielen. Hierzu wurden Wildtyp-DCs sowie DCs defizient an TLR 2 und 4, MyD88 und Trif aus dem Knochenmark einer Maus isoliert, entsprechend mit Y. enterocolitica oder LPS infiziert und mittels ELISA das Zytokin VEGF quantifiziert bzw. unter Verwendung des Westernblots HIF-1alpha identifiziert. An der intrazellulären Detektion von Pathogen-assoziierten molekularen Strukturen sind Proteine wie NOD1 und NOD2 beteiligt. Um eine mRNA-Expression der NOD-Proteine überprüfen zu können, wurde zunächst die mRNA aus den Wildtyp-DCs isoliert, quantifiziert, mittels RT-PCR in cDNA umgeschrieben und im Anschluss die Identifizierung mit einer PCR durchgeführt. Durch synergistische Stimulation der Wildtyp-DCs mit LPS und NOD-Agonisten wurde unter Verwendung des VEGF-ELISA die Induktion VEGF-Sekretion analysiert. Durch Modifikation weiterer Versuche unter Einsatz verschiedener Inhibitoren gegen MAPK-, PI3K- sowie Rho GTPasen konnten die an der Signaltransduktion beteiligten Kinasen und GTPasen ermittelt werden. Zum anderen wurde mit Hilfe des Invasions-Assays und VEGF-ELISA analysiert, ob die Phagozytose von Y. enterocolitica durch DCs den Trigger für die Ausschüttung von VEGF darstellt. Können Yersinien ohne direkten Kontakt zu DCs VEGF induzieren, indem sie bestimmte lösliche Faktoren produzieren, welche eine VEGF-Sekretion auslösen? Diese Fragestellung wurde in einem Transwell-Assay untersucht. VEGF stellt einen Schlüsselfaktor in der Angiogenese dar. Er reguliert multiple biologische Funktionen der Endothelzellen, eingeschlossen das Zellwachstum, - migration, -überleben und die Produktion vasoaktiver Mediatoren. VEGF wird von dem meisten Tumorzellen gebildet. Eine beeinträchtigte Funktion der DCs durch den Einfluss von VEGF bei der Antigenpräsentation aufgrund einer abnormalen Differenzierung stellt einen wichtigen Mechanismus von Tumoren dar, um dem Immunsystem zu entkommen. Um die Differenzierung der in dieser Arbeit verwendeten DCs zu überprüfen, wurde mittels Durchflusszytometrie der Einfluss von VEGF während der Infektion von DCs mit Y. enterocolitica auf die Oberflächenexpression costimulatorischer Moleküle wie MHCII, CD40 und CD86 analysiert. Folgende Ergebnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit erzielt:

1. LPS induziert die HIF-1alpha Aktivierung und die nachfolgende VEGF Sekretion in DCs der Maus über einen TLR-abhängigen Weg. 2. Y. enterocolitica induziert die HIF-1alpha Aktivierung und die nachfolgende VEGF-Sekretion in DCs der Maus über einen TLR-unabhängigen Weg. 3. Y. enterocolitica induziert VEGF in MyD88-/--DCs MyD88-unabhängig/Trif-abhängig und in Trif-/--DCs Trif-unabhängig/MyD88- abhängig. 4. Die VEGF-Sekretion in Y. enterocolitica infizierten DCs ist abhängig von MAPK (p38, JNKII), PI3K und Rho GTPasen. 5. Die Induktion von VEGF wird nicht durch Zytokine wie TNF-alpha; oder IL-1beta; vermittelt. 6. Ein oberflächlicher Kontakt der Yersinien mit DCs reicht aus, um die Sekretion von VEGF aktivieren zu können. Eine Phagozytose ist zur Induktion nicht notwendig. 7. Die Inkubation von DCs mit LPS und NOD-Agonisten (MDP, TriDAP) führt zu einer synergistischen Aktivierung der VEGF-Sekretion. 8. VEGF beeinflusst nicht die Expression costimulatorischer Moleküle (MHCII, CD40, CD86) auf den DCs.

HIF-1alpha sowie VEGF finden in den letzten Jahren immer mehr Beachtung, da sie in verschiedenen Bereichen, wie z.B. der Tumor- und Infektionsbiologie eine tragende Rolle spielen. Obwohl die Aktivierung von HIF-1alpha während eines entzündlichen Geschehens wünschenswert ist, stellt die Suppression von HIF-1alpha einen förderlichen Effekt dar, um Tumorangiogenese und -zelladaption an die hypoxische Bedingungen zu unterdrücken. Unser zunehmendes Verständnis der Signal- und Stoffwechselwege öffnet eine Tür für die Entdeckung neuer Therapiemöglichkeiten zur Behandlung einer Vielzahl entzündlicher Erkrankungen.

DCs are the activest professional antigen presenting cells. They are the mediator to activate native T-cells and the central link between innate an adaptive immunity. Myeloic cells often expect in infected, inflammatory tissue a milieu with hypoxic conditions. They have developed a strategy to adapt on this circumstances. This require the cooperation of HIF-1alpha. HIF-1alpha is a transcription factor and regulates the activation of different gene, for example VEGF. Recent reports show the activation of HIF-1alpha/VEGF pathway under normoxic conditions in monocytes and macrophages by bacterial components. In this work, we demonstrate the role of TLR2 and TLR4 and the adapter molecules MyD88 and Trif to activate HIF-1a and VEGF with help of Y. enterocolitica infected mouse bone marrow derived DCs. We infected wildtyp DCs and DCs deficient of TLR2 and TLR4 as well as the adapter molecules MyD88 and Trif with Y. enterocolitica or LPS. The VEGF and HIF-1alpha expression was analyzed by ELISA and western blotting. Proteins like NOD1 and NOD2 are involved on intracellular detection of pathogen-associated molecular pattern. We used the PCR to identify the isolated mRNA of wildtyp DC and analyzed the expression of mRNA of NOD proteins. We investigated the induction of VEGF secretion by synergistic stimulation of wildtyp DCs with LPS and NOD agonists. While several cascades like MAPK, small GTPases and the PI3K pathway mediate intracellular signaling in response to bacterial antigens, we analyzed whether one of these pathways is involved in TLR independent Y. enterocolitica induced VEGF secretion. With help of the invasion assay and VEGF ELISA we analyze wether phagocytosis of Y. enterocolitica by DCs can trigger the VEGF secretion. Require Y. enterocolitica a direct contact with DCs or produce they soluble factors to induce VEGF secretion? VEGF is a key factor in angiogenesis. VEGF regulate multiple biological functions of endothelial cells and the most tumor cells can produce it. An impared function of DCs by antigen presentation because of abnormal differentiation is a important mechanism to escape to immune system. So we analyzed the influence of VEGF of expression of surface molecules by DCs upon stimulation with bacteria. The expression of MHC class II, CD40 and CD86 was determined by FACS analysis. We have achieved follow results in this work: 1. LPS induces HIF-1alpha and VEGF secretion in mouse DCs dependently of TLR2 and TLR4. 2. Y. enterocolitica induces HIF-1alpha and VEGF secretion in mouse DCs independently of TLR2 and TLR4 and the adaptor molecules MyD88 and Trif. 3. VEGF secretion in Y. enterocolitica infected mouse DCs is dependent of MAPK (p38, JNKII), PI3K and Rho GTPases. 4. The cytokines TNF-alpha and IL-1beta do not induce VEGF secretion in mouse DCs. 5. Y. enterocolitica can induces VEGF secretion without direct contact with mouse DCs. Phagocytosis is not necessary for induction of VEGF secretion. 6. Incubation of mouse DCs with LPS and NOD agonists (MDP, TriDAP) induce the synergistic activation of VEGF secretion. 7. VEGF does not impair the expression of costimulatory molecules (MHC class II, CD40, CD86) of mouse DCs.

In the last years HIF-1alpha and VEGF get more attention for example in biology of tumors or infections, cell metabolism, cell growth, adhesion and angiogenesis. Our increasingly comprehension of signal pathways, which are involved in regulation of cytokin production and signaling of immun cells, help to find new therapies for treatment inflammatory diseases.