Untersuchungen zur Aktivität und Spezifität der rekombinanten humanen Arylsulfatase A mit Hilfe der analytischen Isotachophorese

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-56098
http://hdl.handle.net/10900/45833
Dokumentart: PhDThesis
Date: 2011
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Sonstige
Advisor: Bruchelt, Gernot (Prof. Dr. rer. nat.)
Day of Oral Examination: 2009-05-14
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Analytische Isotachophorese , Cerebrosid-Sulfatase , Metachromatische Leukodystrophie , Multiple Sulfatase-Defizienz , Lysosomale Speicherkrankheit
Other Keywords: Rekombinante humane Arylsulfatase A
Analytical isotachophoresis , Recombinant human arylsulfatase A , Metachromatic leukodystrophy , Multiple sulfatase deficiency
License: http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en
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Inhaltszusammenfassung:

Die metachromatische Leukodystrophie (MLD) ist eine lysosomale Speicherkrankheit, die durch den Funktionsverlust des Enzyms Arylsulfatase A verursacht wird und zur Anreicherung von 3-Sulfo-Galactocerebrosid (Sulfatid) in den Geweben, insbesondere in Oligodendrozyten und Schwann-Zellen, führt. Als Therapie der MLD wird neben der Stammzelltransplantation versuchsweise auch die Enzymersatztherapie mit der rekombinanten humanen Arylsulfatase A (rhASA) eingesetzt. Aufgabe dieser Arbeit war es, die Aktivität und Spezifität der rhASA mit Hilfe der analytischen Isotachophorese (ITP) zu untersuchen und mit derjenigen von Sulfatasen in Leukozytenextrakten, die mittels Dextransedimentation gewonnen wurden, zu vergleichen. Dazu wurden zuerst Untersuchungen zum Abbau des künstlichen Substrats p-Nitrocatecholsulfat (pNCS) durch rhASA unter verschiedenen Inkubationsbedingungen mit Hilfe der Photometrie, einem Standardverfahren zur Diagnose von Speicherkrankheiten, durchgeführt und danach der Abbau von Sulfatid durch rhASA anhand der Dünnschichtchromatographie nachgewiesen. Schliesslich wurde der Umsatz verschiedener Substrate durch rhASA und Leukozytenextrakte mit Hilfe der ITP miteinander verglichen und so die Spezifität der rhASA untersucht. Mit Hilfe der ITP wurde der Umsatz der 3 Substrate pNCS, Ascorbylsulfat und Galactose-6-sulfat durch rhASA und Leukozytenextrakte untersucht. Mit dieser Methode konnte nachgewiesen werden, dass pNCS und Ascorbylsulfat sowohl durch rhASA als auch durch Leukozytenextrakte, Galactose-6-sulfat jedoch nur durch Leukozytenextrakte abgebaut wird, was darauf zurückzuführen ist, dass Galactose-6-sulfat kein Substrat der Arylsulfatase A ist, von anderen Sulfatasen, die in den Leukozytenextrakten vorhanden sind, jedoch sehr wohl umgesetzt wird. Die ITP erlaubt also durch die Auswahl geeigneter Substrate (Sulfate) die Charakterisierung der Aktivität verschiedener Sulfatasen und kann so z.B. durch Verwendung der oben angeführten Substrate in einem einzigen Analysenlauf eine Differenzierung zwischen metachromatischer Leukodystrophie (MLD) und multiplem Sulfatase-Mangel (MSD) ermöglichen, da mit ihr der Abbau mehrerer Substrate simultan verfolgt werden kann.

Abstract:

Metachromatic leukodystrophy (MLD) is a lysosomal storage disease (LSD), which is caused by a functional loss of the enzyme arylsulfatase A and leads to the accumulation of the sphingolipid galactocerebroside-3-sulfate (sulfatide) in tissues, especially in oligodendrocytes and Schwann cells. In lieu of stem cell transplantation, enzyme replacement therapy with recombinant human arylsulfatase A (rhASA) is experimantally being used as a treatment of MLD. The purpose of this thesis is to investigate the activity and specificity of rhASA by using analytical isotachophoresis (ITP) and to compare it with those of sulfatases in leukocyte extracts won by dextransedimentation. To begin with, this thesis investigated the degradation of the artificial substrate p-nitrocatecholsulfate (pNCS) through rhASA under different incubation conditions using photometry, a standard method to diagnose storage diseases and, after that, the degradation of sulfatide through rhASA was verified using thin layer chromatography. Finally, the specificity of rhASA has been investigated by comparing the degradation of different substrates through rhASA and leukocyte extracts using ITP. Degradation of the three substrates pNCS, ascorbylsulfate and galactose-6-sulfate through rhASA and leukocyte extracts was investigated using ITP. This method verified that pNCS and ascorbylsulfate degrade through rhASA as well as through leukocyte extracts, whereas galactose-6-sulfate degrades only through leukocyte extracts, which is due to galactose-6-sulfate not being a substrate of arylsulfatase A but still degrading through other sulfatases existing in leukocyte extracts. Hence ITP allows characterising the activity of different sulfatases through selection of suitable substrates (sulfates), and facilitates, e.g. by using the substrates mentioned above, a differentiation between metachromatic leukodystrophy (MLD) and multiple sulfatase deficiency (MSD) in only one analysis stage, since degradation of several substrates can be analysed simultaneously.

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