Inhibition des apoptotischen Zelltodes von Erythrozyten durch NO

Abstract

Stickstoffmonoxid (NO) kann bekanntermaßen in kernhaltigen Zellen die Induktion von Apoptose durch S-Nitrosylierung von Protein-Thiolgruppen inhibieren. Dieses Signalmolekül kann von Erythrozyten produziert und in ihnen gespeichert werden. Erythrozyten selbst können eine Form des Zelltodes erfahren, die der Apoptose kernhaltiger Zellen ähnlich ist, die Eryptose. Diese Eryptose wird unter anderem durch die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration und/oder durch die Bildung von Ceramid vermittelt und ist durch Phosphatidylserin-(PS)-Exposition auf der Zelloberfläche und durch Zellschrumpfung charakterisiert. Die vorliegende Studie befasst sich mit der Frage, ob NO die Mechanismen, die zur Eryptose führen, und so das Apoptoseverhalten der Erythrozyten ebenfalls beeinflussen kann. Hierzu wurden die PS-Exposition durch Annexin-V-Bindung und das Zellvolumen im Forward scatter durchflusszytomerisch bestimmt. Der Calcium Ionophor Ionomycin erhöhte in einer Konzentration von 0,1 µM die zytosolische Calcium-Konzentration und löste dadurch Annexin-V-Bindung und Zellschrumpfung aus. Diese Annexin-V-Bindung und die Abnahme des forward scatter, nicht hingegen die Erhöhung der Calciumkonzentration, konnten durch die Zugabe von NO-Donatoren wie z. B. Nitroprussid in Konzentrationen von 1 nM bis 1 µM und NOC-15 (100 µM) inhibiert werden. Höhere Konzentrationen von Nitroprussid (0,1 und 1 mM) lösten allerdings selbst Eryptose aus. Glucosedepletion, C6-Ceramid (3 µM), hypertone (850 mOsm) und chloridfreie Lösung verursachten ebenfalls Annexin-V-Bindung, wobei NO alle diese Effekte signifikant hemmen konnte. Dibutyryl-cGMP (1 mM) schwächte die calcium-, aber nicht die ceramidvermittelte Annexin-V-Bindung ab. Ionomycin-Behandlung der Zellen verringerte den Grad an S-nitrosylierten Protein-Thiolgruppen und die Thioredoxin-Aktivität. Auch diese Effekte waren durch Zugabe von NO-Donatoren reversibel. Die Aussonderung von Erythrozyten in der Milz und aus dem zirkulierenden Blutstrom und somit die Lebensdauer der Zellen waren in eNOS-Knockout-Mäusen gegenüber Wildtyp-Kontrollmäusen signifikant erhöht. Aus diesen Ergebnissen folgt, dass NO an der Regulation von erythrozytärem Überleben und Zelltod beteiligt ist. Diese Effekte vermittelt es teilweise über einen cGMP-abhängigen Signalweg, durch eine Erhöhung der Protein S-Nitrosylierung und durch eine Thioredoxin-Aktivierung nach ionomycinvermitteltem Stress.

Nitric oxide (NO) is known to counteract apoptosis by S-nitrosylation of protein thiol groups. NO is generated and stored in erythrocytes, which may undergo eryptosis, a suicidal cell death similar to apoptosis of nucleated cells. Eryptosis is triggered by increased cytosolic Ca2+ activity and/or ceramide and characterized by cell shrinkage and phosphatidylserine exposure at the cell surface. The present study explored whether nitric oxide could interfere with the machinery underlying eryptosis. To this end, erythrocyte phosphatidylserine exposure (annexin V-binding) and cell volume (forward scatter) were determined by flow cytometry. The Ca2+ ionophore ionomycin (0.1 µM) increased cytosolic Ca2+ activity, triggered annexin binding, and decreased forward scatter. The annexin binding and decrease of forward scatter but not the increase of cytosolic Ca2+ activity were reversed by the NO-donor nitroprusside (1 µM) and papanonoate (100 µM). Higher concentrations of nitroprusside (0.1 and 1 mM) stimulated eryptosis. Glucose depletion, exposure to C6-ceramide (3 µM), hypertonic (addition of 550 mM sucrose), and isotonic (replacement of Cl- with gluconate) cell shrinkage all triggered annexin V binding, effects all reversed by nitroprusside (1 µM). Dibutyryl–cGMP (1 mM) blunted the ionomycin- but not the ceramide-induced annexin V binding. Ionomycin decreased protein nitrosylation and thioredoxin activity, effects reversed by the NO-donor papanonoate. Clearance of erythrocytes from circulating blood was significantly faster in eNOS knockout mice than in their wild-type littermates. In conclusion, nitric oxide participates in the regulation of erythrocyte survival, an effect partially mimicked by cGMP and paralleled by alterations of protein nitrosylation and thioredoxin activity.