VacA von Helicobacter pylori induziert Zell-Zyklus-Arretierung am Modell der Jurkat-Zelle

Abstract

Helicobacter pylori (H. pylori) kann die Magenschleimhaut des Menschen trotz einer reaktiven Immunantwort chronisch infizieren. Das gramnegative Bakterium sezerniert das Vacuolating cytotoxin A (VacA) und hemmt damit die Proliferation der T Lymphozyten. In die Zellumgebung gelöst diffundiert der Virulenzfaktor in die entzündete Mucosa und arretiert den Zellzyklus der Lymphozyten in der G1-Phase. Am Modell der Jurkat-Zelle wurden die zellfreien Überstände der H.-pylori-Stämme P12 (Wildtyp), P12 Delta(VacA) (knock out null Mutant) und P12 Delta(6-27) gegen eine Kontrolle getestet. Unter Verwendung von BrdU ergab sich folgende Fragen: 1. Hemmt gelöstes VacA Jurkat-Zellen in der G1-Phase? 2. Kann die Zyklusarretierung in Co-Kultivierung mit mitogenen Stimuli oder nach Säureaktivierung potenziert werden? Jurkat-Zellen wurden mit den zellfreien Extrakten der H. pylori Kulturen unter Beifügung von BrdU (c = 20 µM) für 24 Stunden inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS und Fixieren mit 70 % Äthanol ruhten die Proben für 24 Stunden bei – 20 °C. Es folgte die Inkubation mit RNase und kaltem Pepsin, jeweils im Wasserbad, sowie die DNA-Denaturierung mit (2N) HCl bei RT. Anti-BrdU Antikörper der Maus demarkierte de novo synthetisierte Chromosomen und mit FITC konjugierte Anti-Maus Antikörper erlaubten diesbezüglich den indirekten Nachweis. Nach DNA-Färbung mit Propidium Iodid folgte die Auswertung im Zytometer. Dabei konnte die hemmende Wirkung des gelöstem VacA auf den Zellzyklus und zwar nach Säureaktivierung mit einem signifikanten Unterschied zur Kontrolle und zu den Extrakten der isogenen Mutanten deutlich gezeigt werden. Bei gleichzeitiger ConA Stimulierung ohne Säureaktivierung war der Unterschied dagegen nur gering. Unter Stimulierung mit PMA/Ionomycin und Säureaktivierung arretierte VacA signifikant mehr Zellen in der G1-Phase als in der Kontrolle und P12Δ(VacA). Diese Daten reihen sich gut in die Ergebnisse anderer Forschergruppen ein. In Übereinstimmung mit Gebert und Sundrud konnte diese Untersuchung aufzeigen, dass die phasenarretierende Wirkung auf den Virulenzfaktor VacA zurückgeführt werden kann. Der zellfreie Überstand des null VacA Mutanten ließ keinen Unterschied zur Kontrollprobe erkennen. Diese Ergebnisse können somit einen Beitrag zum Verständnis der Pathogenität von H. pylori liefern.

The experiments show the different cell-cycle-arrest on the model of Jurkat-cell induct by VacA of Helicobacter pylorie P12 (wildtyp) comperd to the mutants P12 Delta(VacA) (knock out null Mutant) und P12 Delta(6-27).