Untersuchungen zur Regulation der Phosphorylierung des Insulin-Rezeptor-Substrates-1 an Serin 318

Abstract

Die genauen molekularen Mechanismen der Insulinresistenz, welcher eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 2 zukommt, sind bis heute nicht vollständig aufgeklärt. Bekannt ist jedoch, dass die zelluläre Insulinresistenz u. a. mit einer vermehrten Phosphorylierung des Insulinrezeptorsubstrates-1 (IRS-1) an mehreren Serinen und Threoninen einhergeht. IRS-1 wird nach Stimulation mit dem Phorbolester 12-OTetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) bzw. Insulin an der kürzlich identifizierten Serinstelle 318 phosphoryliert. Der genaue Signalweg, der zu dieser Phosphorylierung führt, ist bislang nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit galt es daher zu untersuchen, ob Kinasen, für die beschrieben ist, dass sie IRS-1 phosphorylieren können, an dieser TPA- bzw. Insulin-induzierten Phosphorylierung beteiligt sind. Die Phosphorylierung von IRS-1 an Serin 318 wurde in C2C12-Myotuben mittels Western-Blotting nachgewiesen. Die 30-minütige Stimulation mit TPA führte zu einer starken Phosphorylierung von IRS-1 an Serin 318. Durch 30-minütige Vorinkubation mit dem PKCInhibitor Bisindolylmaleimid I (500 nM), konnte die Phosphorylierung nach 30-minütiger Stimulation mit 100 nM TPA deutlich abgeschwächt und die Phosphorylierung nach 30-minütiger Stimulation mit 1 und 10 nM TPA auf das basale Niveau reduziert werden. Die Stimulation mit 100 nM Insulin (30 min) führte ebenfalls zu einer starken Phosphorylierung von IRS-1 an Serin 318. Die Vorinkubation mit dem Inhibitor der c-Jun-N-terminalen Kinase (JNK) SP600125 (50 mikroM, 30 min) führte ebenso zu einer deutlichen Reduktion der Insulin-induzierten IRS-1-Phosphorylierung an Serin 318 wie der Einsatz des mammalian target of Rapamycin (mTOR)- Inhibitors Rapamycin (25 nM) und des Phosphatidylinositol-3 (PI3)-Kinase- Inhibitors LY294002 (10 mikroM). Der JNK-Aktivitäts-Immunoassay zeigte eine Insulin-induzierte Phosphorylierung von c-Jun, die durch Vorinkubation mit SP600125 wieder auf das Basalniveau abgesenkt werden konnte. Die Insulin-Stimulation führte ebenfalls zu einer verstärkten Phosphorylierung der PI3-Kinase- und mTORSubstrate Akt/Proteinkinase-B und p70S6-Kinase, die nach Vorinkubation mit LY294002 bzw. Rapamycin deutlich abnahm. Unsere Ergebnisse bestätigen also, dass PI3-Kinase, mTOR und JNK auch in unserem Zellsystem der C2C12-Myotuben durch Stimulation mit Insulin aktiviert werden. Insulinunabhängig führte die Stimulation mit dem JNK-Aktivator Anisomycin (25 mikrog/ml, 30 min), dem mTOR-Aktivator Leucin (5 mM, 30 min) und dem Produkt der PI3-Kinase PtdIns(3,4)P2 (10 mikroM, 30 min) zu einer verstärkten Ser318- Phosphorylierung, die mit den jeweils spezifischen Inhibitoren SP600125 (50 mikroM, 30 min) bzw. Rapamycin (25 nM, 30 min) wieder auf das Basalniveau gesenkt werden konnte. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen die Beteiligung von klassischen und/oder neuen PKC-Isoformen an der TPA-induzierten Ser318-Phosphorylierung nahe. Darüber hinaus weisen sie darauf hin, dass neben der PKC-zetta auch JNK und der PI3-Kinase/mTOR-Signalweg die Insulin-induzierte Phosphorylierung von IRS-1 an Serin 318 vermitteln.

Increased serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate-1 (IRS-1) has been found to be associated with impaired tyrosine phosphorylation by the insulin receptor and elevated IRS-1 protein degradation, both leading to insulin resistance. However, serine-phosphorylation in IRS-1 may also enhance insulin signal transduction. Several specific serine phosphorylation sites have been described within IRS-1 including serine 318 (Ser318) that we have recently identified and characterized. Rapid insulin-induced Ser318 phosphorylation, mediated by the atypical protein kinase C zetta (PKC-zetta), was found to enhance insulin signaling. However, in Ser318 phosphorylation after chronic insulin treatment, leading to an attenuation of insulin signal transduction, kinases other than PKC-zetta appear to be implicated. Therefore, we aimed to identify such kinases in the present study. We found that in C2C12 myotubes chronic exposure to insulin or phorbol ester markedly increased the Ser318 phosphorylation in IRS-1. Ser318 phosphorylation in IRS-1 after chronic insulin treatment was found to be mediated by JNK and the PI 3-kinase/mTOR pathway acting in parallel. JNK, PI 3-kinase, and mTOR did not appear to play a major role in TPA-induced IRS-1 Ser318 phosphorylation that was found to be, at least partly, mediated by classical or novel PKC. In conclusion, with JNK and the PI 3-kinase/mTOR pathway as mediators of Ser318 phosphorylation after chronic exposure to insulin we have identified kinases that have previously been reported to play key roles in phosphorylation of other serine residues in IRS-1.