TRPC channels in erythrocytes: Role for basal Ca2+ leak and suicidal cell death

DSpace Repository


Dateien:

URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-30919
http://hdl.handle.net/10900/45137
Dokumentart: Dissertation
Date: 2007
Language: English
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Sonstige
Advisor: Huber, Stephan PD Dr.
Day of Oral Examination: 2007-10-26
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer , Phosphatidyl-serin , Erythrozyt , Apoptosis , Calcium
Other Keywords:
FACS , apoptosis , calcium , phosphatidylserine , erythrocyte
License: Publishing license including print on demand
Order a printed copy: Print-on-Demand
Show full item record

Inhaltszusammenfassung:

Es ist bekannt, daß Prostaglandin-E2 (PGE2) den suizidalen Zelltod sowohl von kernhaltigen Zellen als auch von kernlosen Erythrozyten (Apoptose) auslöst. In Erythrozyten induzieren Cl- -Depletion, Energie-Depletion, osmotischer Schock oder oxidativer Streß den suizidalen Zelltod über die Bildung von PGE2. Die Auslösung der Apoptose von Erythrozyten ist mit der Aktivierung nichtselektiver Kationenkanäle, durch die es zum Einstrom von Ca2+ und nachfolgender Zellschrumpfung und Aufhebung der Asymmetrie der Zellmembran mit Phospatidylserin (PS)-Exposition auf der Zelloberfläche kommt, verbunden. In der vorliegenden Arbeit wurden humane leukämische K562 Zellen wegen ihrer erythrozytären Eigenschaften als ein zelluläres Modell für Erythrozyten verwendet. In K562 Zellen wurde untersucht, ob PGE2 ähnlich wie bei Erythrozyten die Apoptose von kernhaltigen Zellen durch die Aktivierung nichtselektiver Kationenkanäle auslöst. Ggf. sollte die molekulare Identität dieses nichtselektiven Kationenkanals geklärt werden. Dazu wurden die Ca2+-Aktivität mit Hilfe des Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffes Fluo3, das Mitochondrienpotential durch die Fluoreszenz von DePsipher, die Phosphatidylserin-Exposition durch die Bindung von Annexin V, die Aktivierung von Caspasen durch die Fluoreszenz von caspAce, das Zellvolumen durch das Vorwärtsstreulicht in der Durchflußzytometrie sowie die DNS-Fragmentierung in einem photometrischen Enzymimmunoassay bestimmt. Die Stimulation von humanen leukämischen K562 Zellen mit PGE2 (50 µM) führte zu erhöhter zytosolischer Ca2+-Konzentration, zu einem verminderten Signal des Vorwärtsstreulichtes, zur Depolarisation der Mitochondrienmembran, zu vermehrter Annexin V-Bindung, zur Aktivierung von Caspasen und zur Fragmentierung der DNS. Die spezifische Herunterregulation des Ca2+-permeablen transient receptor potential Kationenkanals TRPC7 durch RNAi verringerte die PGE2- induzierte PS-Exposition und Fragmentierung der DNS signifikant. Daraus darf gefolgert werden, daß K562 Zellen Ca2+-permeable TRPC7 Kanäle exprimieren, die von PGE2 aktiviert werden und an der Auslösung der Apoptose beteiligt sind. Aufgrund der Ergebnisse in den kernhaltigen K562 Zellen wurde als nächstes die Beteiligung von TRPC-Kanälen an der Auslösung der „Apoptose“ (Eryptose) von Erythrozyten untersucht. Mittels RT-PCR wurde bestätigt, daß erythrozytäre Vorläuferzellen, die aus peripherem menschlichen Blut gewonnen wurden, mRNA exprimieren, die für den nichtselektiven Kationenkanal TRPC6 kodiert. Durch Western Blot Analyse wurde TRPC6 in Erythrozytenmembranen sowohl vom Menschen als auch von Wildtypmäusen, nicht aber in TRPC6-defizienten Mäusen (TRPC6-/-) nachgewiesen. Ghosts aus menschlichen Erythrozyten wurden durch Hämolyse in EGTA-gepufferter Lösung, die Fluo3 enthielt, gewonnen. In der Durchflußzytometrie wurde gezeigt, daß der Einstrom von Ca2+ in die Ghosts durch das Reduktionsmittel Dithiothreitol (1 mM) und durch Ethylisopropylamilorid (50 µM) und Amilorid (1 mM), beides Hemmstoffe des erythrozytären Kationenkanals, inhibiert wurde. Ferner wurde der Ca2+-Einfluß nach Beladung der Ghosts mit Antikörpern gegen TRPC6 oder TRPC3/6/7 vermindert, nicht jedoch nach Beladung mit Antikörpern gegen TRPM2 oder TRPC3 oder nach Beladung mit Antikörpern, die mit dem immunisierenden Peptid präinkubiert worden waren. Die Ca2+-Konzentration im Fließgleichgewicht der Zelle, der Cl--sensitive Ca2+-Einstrom, das Cl--sensitive-Zellschrumpfen und die Cl--sensitive-Aufhebung der Asymmetrie der Zellmembran waren signifikant geringer in Erythrozyten von TRPC6-/--Mäusen im Vergleich zu Erythrozyten ihrer Wildtypartgenossen. Als Schlußfolgerung exprimieren menschliche Erythrozyten und Mäuseerythrozyten nichtselektive TRPC6 Kationenkanäle, die sowohl am konstitutiven Kationenleck als auch am Ca2+-induzierten suizidalen Zelltod beteiligt sind.

Abstract:

Prostaglandin-E2 (PGE2) is known to trigger suicidal death of nucleated cells and enucleated erythrocytes (apoptosis). In erythrocytes, Cl- depletion, energy depletion, osmotic shock, or oxidative stress also induce suicidal cell death via the formation of PGE2. The triggering of erythrocyte “apoptosis” (eryptosis) involves the activation of nonselective cation channels leading to Ca2+ entry followed by cell shrinkage and triggering of Ca2+ sensitive cell membrane scrambling with phosphatidylserine (PS) exposure at the cell surface. As a cell model for erythrocytes, K562 human leukaemia cells were chosen due to their erythroid features. Experiments were performed in K562 cells to explore whether PGE2 induces apoptosis of nucleated cells similarly through cation channel activation and to possibly disclose the molecular identity of the cation channels involved. To this end, Ca2+ activity was estimated from fluorescence of the Ca2+-sensitive fluorescence dye Fluo3, mitochondrial potential from DePsipher fluorescence, phosphatidylserine exposure from annexin V binding, caspase activation from caspAce fluorescence, cell volume from FACS forward scatter, and DNA fragmentation utilizing a photometric enzyme immunoassay. Stimulation of K562 cells with PGE2 (50 µM) increased cytosolic Ca2+ activity, decreased forward scatter, depolarized the mitochondrial potential, increased annexin V binding, led to caspase activation, and resulted in DNA fragmentation. Gene silencing of the Ca2+-permeable transient receptor potential cation channel TRPC7 significantly blunted PGE2-induced triggering of PS exposure and DNA fragmentation. In conclusion, K562 cells express Ca2+-permeable TRPC7 channels which are activated by PGE2 and participate in the triggering of apoptosis. The results in nucleated K562 cells suggest the investigation of the involvement of TRPC channels in the triggering of eryptosis. RT-PCR revealed that erythroid progenitor cells differentiated from human peripheral blood expressed messenger RNA encoding for the non-selective cation channel TRPC6. Western blotting indicated expression of TRPC6 protein in erythrocyte membranes from man and wild type mice but not from TRPC6 deficient mice (TRPC6-/-). According to flow-cytometry, Ca2+ entry into human erythrocyte ghosts prepared by hemolysis in EGTA-buffered solution containing Fluo3 was inhibited by the reducing agent dithiothreitol (1 mM) and the erythrocyte cation channel blockers ethylisopropylamiloride (50 µM) and amiloride (1 mM). Loading of the ghosts with antibodies against TRPC6 or TRPC3/6/7 but neither with antibodies against TRPM2 or TRPC3 nor with antibodies pre-adsorbed with the respective immunizing peptides inhibited human ghost Ca2+ entry. Steady state Ca2+ activity as well as Cl- sensitive Ca2+ entry, cell shrinkage, and phospholipid scrambling were significantly blunted in erythrocytes from TRPC6-/- mice as compared to erythrocytes from their wildtype littermates. In conclusion, human and mouse erythrocytes express TRPC6 non-selective cation channels which participate in both, constitutive cation leak and Ca2+ induced suicidal death.

This item appears in the following Collection(s)