Evaluierung von PCR-Methoden zur Identifizierung und Differenzierung von Erregern der Zygomykose und Aspergillose

Abstract

Aspergillen und Mucormykosen sind ubiquitär verbreitete Fadenpilze, die bei immunsupprimierten Patienten schwere, oft tödliche, Infektionen hervorrufen können. Der frühzeitigen Diagnostik und Therapie kommt zur Senkung der Letalität eine große praktische Bedeutung zu, wobei die optimale antimykotische Therapie isolat- und speziesabhängig ist. Diese Pilzinfektionen sind mit den bislang zur Verfügung stehenden diagnostischen Mitteln nur unzureichend zu identifizieren und zu differenzieren. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Evaluation zweier semi-nested PCR-Methoden zur Identifizierung und Differenzierung von Erregern der Mucormykosen und Aspergillosen in Paraffin eingebetteten Gewebeproben und nativen Biopsien.

Methode Mucormykosen. Als Zielsequenz wurde die 18S rDNA gewählt. Das äußere Primerpaar ZM1: 5'-ATT ACC ATG AGC AAA TCA GA-3' und ZM 2: 5'-TCC GTC AAT TCC TTT AAG TTT C-3' amplifiziert ein 407 bis 408 bp langes Fragment. Bei der semi-nested PCR wird durch ZM 1 und ZM 3: 5'-CAA TCC AAG AAT TTC ACC TCT AG-3' ein 176 bis 177 bp langes Fragment des ersten Produktes begrenzt. Aspergillen. Diese PCR wurde in Anlehnung an die Arbeit von Bretagne et al. (1995) aufgebaut. Sie dient dem Nachweis mitochondrialer Aspergillus-DNA. Mit den Primern P 1: 5'-GAA AGG TCA GGT GTT CGA GTC AC-3' und P 2: 5'-CTT TGG TTG CGG GTT TAG GGA TT-3' wird ein 135 bp langes Fragment der mitochondrialen DNA von Aspergillus spp. amplifiziert. Zur Erhöhung der Sensitivität und Spezifität wurden P 1 und P 2 als semi-nested PCR-Primer verwendet und die Methode um einen äußeren Primer, Asp 2, ergänzt (Asp 2: 5'-GGG AGT TCA AAT CTC CCT TGG G-3'). P2 und Asp 2 amplifizieren ein 201 bp langes Fragment der mitochondrialen DNA von Aspergillus fumigatus.

Ergebnisse Insgesamt wurden 77 Proben untersucht, davon waren 66 Paraffin eingebettete Gewebeproben und elf native Biopsien. Bei 45 von 61 histologisch nachgewiesenen Pilzinfektionen wurde mit den beiden PCR-Verfahren die DNA von einem oder mehreren pathogenen Pilzen amplifiziert (73,8%). Die Sequenzierung der PCR-Produkte ermöglichte eine Identifizierung der Spezies oder zumindest eine Identifizierung der Gattung des ursächlichen Pilzes. Zwölf PCR-Produkte wurden als spezifische DNA von Rhizomucor spp. identifiziert. Cunninghamella spp. wurde in sechs Gewebeproben nachgewiesen, in weiteren fünf Proben DNA der Spezies Absidia corymbifera sowie spezifische DNA der Arten Rhizopus oryzae und Mucor hiemalis in jeweils zwei Gewebeproben. Die 24 PCR-Produkte der Aspergillus-spezifischen PCR wurden allesamt als Aspergillus fumigatus identifiziert, nur in einem Fall wurde DNA sowohl von A. fumigatus als auch von A. nidulans nachgewiesen.

Diskussion Die zwei erstmalig getesteten PCR-Verfahren zur Identifizierung und Diskriminierung von Aspergillosen und Zygomykosen wurden erfolgreich evaluiert. Bei Patienten mit invasiver Aspergillose und/oder Zygomykose konnten Amplifikate nachgewiesen werden, nicht aber aus Proben mit anderen Pilzinfektionen. Mit den spezifischen PCR-Methoden und der folgenden Sequenzierung können innerhalb von 24 - 48 Stunden Aspergillus- und Mucorales-Arten in Gewebeproben nachgewiesen und identifiziert werden. Diese Methoden ergänzen sich damit hervorragend zur Diagnostik, so dass eine frühe gezielte antimykotische Therapie begonnen werden könnte.

Agents of aspergillosis and mucormycosis are considered ubiquitous filamentous fungi that can cause life threatening diseases in immunocompromised patients. To lower lethality these infections require different antifungal treatments depending on the in vitro susceptibility of the causative isolate or species. Those different mycotic infections cannot be distinguished and identified sufficientely by available diagnostic methods. The aim of this thesis was to evaluate the identification and discriminatory efficacy of two seminested PCR assays in paraffin wax embedded tissue sections originating from differrent laboratories and from tissue samples

Methods Mucormycosis. The 18S rDNA was chosen as target sequence. The outer primers ZM1: 5'-ATT ACC ATG AGC AAA TCA GA-3' and ZM 2: 5'-TCC GTC AAT TCC TTT AAG TTT C-3' amplify a product of 407-408 basepairs (bp) in length. The nested reaction was performed using the primers ZM 1 and ZM 3: 5'-CAA TCC AAG AAT TTC ACC TCT AG-3', which amplify a fragment of the first product of 176-177 bp. Aspergillosis. A PCR assay described by Bretagne et al. (1995) targeting the mitochondrial DNA of Aspergillus spp. was modified. The primers P 1: 5'-GAA AGG TCA GGT GTT CGA GTC AC -3' and P 2: 5'-CTT TGG TTG CGG GTT TAG GGA TT-3' amplify a 135-bp-long fragment. To increase sensitivity and specificity P 1 and P 2 were used as seminested PCR-Primers and the method was supplemented by an outer primer Asp 2 (Asp 2: 5'-GGG AGT TCA AAT CTC CCT TGG G-3'). P 2 and Asp 2 amplify a fragment of 201 bp of the mitochondrial DNA of Aspergillus fumigatus.

Results In total 77 samples were screened for fungal DNA, 66 paraffin wax embedded tissue sections and eleven native biopsies. In 45 of 61 samples with histopathological diagnosis of an invasive fungal infection, DNA from one or more pathogenic fungus could be amplified (73,8%). Through sequencing the PCR products an identification of the species or at least the genus of the causal fungus was possible. Twelve PCR products were identified as specific DNA from Rhizomucor spp.. Cunninghamella spp. was amplified in six samples, in other five samples DNA of the species Absidia corymbifera as well as specific DNA of Rhizopus oryzae und Mucor hiemalis in two tissue samples at a time. The 24 PCR products of the Aspergillus-PCR were all identified as Aspergillus fumigatus and just in one case was DNA from A. fumigatus and A. nidulans found.

Discussion The two for the first time tested PCR assays for the discrimination and identification of agents of mucormycosis and aspergillosis were evaluated successfully. In patients with invasive mucormycosis and/or aspergillosis amplifications could be detected but not from samples with other fungal infections. With these specific PCR assays and the following sequencing, agents of the genus Aspergillus and the order Mucorales could be detected and identified within 24-28 hours. These methods were found to support the available diagnostic methods so that an early specific antifungal therapy can be started.