Nachweis von Histoplasma capsulatum-DNA in Blutproben von Mäusen und humanen Gewebeproben mittels PCR-Verfahren

Abstract

IInvasive Mykosen sind lebensbedrohliche Erkrankungen vor allem bei Patienten mit Defekten des zellulären Immunsystems. Auch bei der Histoplasmose, verursacht durch den dimorphen Pilz Histoplasma capsulatum, ist ein disseminierter Befall nach Inhalation der Erreger bei Immungeschwächten möglich. Nur die frühzeitige Diagnostik einer Histoplasmose bietet die Möglichkeit einer rechtzeitigen antimykotischen Therapie. Diagnostische Methoden sollten sensitiv und spezifisch und möglichst innerhalb eines Arbeitstages durchführbar sein. Sowohl Verfahren zum Direktnachweis wie die kulturelle Anzucht der Pilzzellen oder die mikroskopische Identifizierung in Patientenmaterial als auch serologische Methoden mit Antikörper- und Antigen-Nachweis erfüllen diese Anforderungen jedoch nur teilweise.

Bereits 2001 war von Bialek et al. eine 18 S DNA-PCR-Methode zum Nachweis von Histoplasma capsulatum-spezifischer DNA im Tiermodell aufgebaut worden. In der vorliegenden Arbeit zeigten ergänzende Untersuchungen, dass der Nachweis der Pilz-DNA auch im Blut infizierter Mäuse möglich ist. Dabei stellte sich jedoch heraus, dass es aufgrund der hoch konservierten Zielregion innerhalb der 18 S rDNA häufig zu einer Kreuzreaktion der Primer kommt. Wir entwickelten daher eine neue PCR mit Zielregion in einem Gen, das für ein Histoplasma capsulatum-spezifisches Protein kodiert und evaluierten erstmals beide Methoden an menschlichem Untersuchungsmaterial. Die Ergebnisse der Untersuchung von 100 Formalin-fixierten humanen Gewebeproben aus unterschiedlichen Organen zeigten, dass mit beiden PCR-Methoden der Nachweis von Histoplasma capsulatum-spezifischer DNA gelingt und beide die gleiche Sensitivität besitzen. Die Sequenzanalyse der Amplifikate bewies jedoch, das mit der neuen 100 kDa-PCR im Gegensatz zur 18 S r DNA-PCR kein falsch positives Ergebnis erzielt wurde. Mit dieser neuen nested-PCR Methode gelang somit die Entwicklung einer schnellen und dennoch spezifischen und sensitiven Methode, die für die Diagnostik der Histoplasmose von großer Bedeutung sein könnte.

Histoplasma capsulatum is a dimorphic fungal pathogen and the etiologic agent of histoplasmosis, a pulmonary disease that is usually asymptomatic but may be severe or fatal in immunosuppressed patients. Early diagnosis in these patients is therefore important. The diagnosis of histoplasmosis is mainly based on culture, antigen detection and histopathology. PCR assays have been proposed for the diagnosis of invasive fungal disease because of their higher sensitivity and earlier results. Bialek et al. have described a sensitive 18 S ribosomal DNA nested PCR assay to monitor murine histoplasmosis. Due to highly conserved regions, these PCR assay bears the risk of nonspecific amplifications. Therefore we developed a nested PCR assay targeting a gene for a unique protein, the so-called 100-kDa-like protein. In this study, we evaluated the two nested PCR assays for the detection of Histoplasma capsulatum DNA in Human Tissue. Both methods were capable of identifying the fungal DNA in the formalin-fixed, paraffin-embedded human tissue samples. The two assays were similarly sensitive in identifying Histoplasma capsulatum. However no false-positive results were obtained in the new PCR assay targeting the gene coding for the specific 100-kDa like protein. In contrast, the 18 S rDNA nested PCR assay revealed a high rate of false-positive results, which therefore requires sequencing to identify. In conclusion, we have developed a nested PCR assay specific for the diagnosis of Histoplasma capsulatum DNA in human tissue.