In-Situ-Identifikation von Mikroorganismen in einem Karstaquifer mittels Ribosomaler RNA-Technologie

Abstract

Von August 1998 bis August 2000 wurden Wasserproben und Biofilme aus der Wulfbachquellhöhle bei Mühlheim (Donau) mikrobiologisch untersucht. Es zeigte sich, daß zwei der in Richtung Siedlungsflächen ziehenden unterirdischen Wasserzubringer (Siphon 8b und Sologang) wasserchemisch höher belastet waren als die unter landwirtschaftlich genutzten Flächen befindlichen. Die für mehrere Wochen im Karstaquifer exponierten Glasobjektträger erwiesen sich als eher dünn besiedelt. Größere Zellzahlen bis 6,1 x 10^6 / mg Trockengewicht konnten dagegen während des niederschlagsreichen Frühjahrs 2000 auf Sedimentpartikeln nachgewiesen werden. Mit einem speziell für die Untersuchung von Sedimenten mit rRNA-gerichteten Oligonukleotidsonden optimierten Protokoll konnte gezeigt werden, daß fast alle mit der eubakteriellen Sonde EUB338 markierbaren Bakterien der beta- und gamma-Subklasse der Proteobakterien zuzurechnen sind. Mit zurückgehender Quellschüttung sank die Zahl der mit EUB338 detektierbaren Zellen kontinuierlich und das bakterielle Spektrum verschob sich von der zu Beginn des Frühjahrs dominierenden gamma-Subklasse hin zur beta-Subklasse. Um die biofilmbildenden Bakterien bis auf Speziesebene zu charakterisieren, wurden auf 100-fach verdünntem R2A-Agar bei 9°C kultivierte Organismen dieser beiden Gruppen sequenziert (16S rRNA-Gene) und cluster- bzw. speziesspezifische Sonden für diese Organismen angefertigt. Insgesamt konnten am 16.04.2000 87,7 % der mit der eubakteriellen Sonde EUB338 markierten Organismen in einer der folgenden phylogenetischen Einheiten eingeordnet werden: Oxalobacter - Gruppe (24,3 ), Beta1- Subgruppe der Proteobakterien (34,8 ), Pseudomonas - Gruppe (28,6 ). 52 % konnten bis auf Speziesebene charakterisiert werden. 8 der Isolate besitzen weniger als 97 % 16S rRNA-Ähnlichkeit mit bereits in den öffentlichen Datenbanken vorhandenen Sequenzen und sind daher als neue Spezies anzusprechen.

Between August 1998 and August 2000 water samples und biofilms from the Wulfbach Resurgence (Mühlheim a.d. Donau) were examined using microbiological methods. It was found that two of the underground water conduits (Siphon 8b and Sologang) which were heading towards village areas were much more contaminated from a water chemistry point of view than purely agriculturally used areas. Only small numbers of microorganisms were detected on several glass slides which had been exposed in the cave for some weeks. Much higher cell counts of up to 6.1 x 10^6 / mg of dry weight could however be determined on sediment particles during the rainy spring of 2000. Using a protocol which had been optimized for the detection of bacteria in sediment biofilms it could be demonstrated that nearly all of the bacteria labeled with the eubacterial probe EUB338 could be assigned to the beta and gamma subclass of Proteobacteria. Proportionally to the reduction in water flow, the number of cells that could be marked with EUB338 was diminished and the bacterial spectrum shifted from the gamma subclass which had dominated the biofilms during the spring to the beta subclass of Proteobacteria. To identify the biofilm - forming bacteria at the species level samples were incubated on 100-fold diluted R2A agar at 9°C and 16S rRNA genes of selected isolates were sequenced. Cluster- and species-specific oligonucleotide probes were designed. On April 16, 2000 87.7 % of all organisms which could be labeled with probe EUB338 could be assigned to one of the following phylogenetic groups: Oxalobacter group (24.3 ), beta1 subgroup of Proteobacteria (34.8 ), Pseudomonas group (28.6 ). 52 % could be characterized at the species level. Eight of the sequenced isolates were found to display less than 97 % 16S rRNA similarity with sequences in public databases and thus have to be regarded as novel species.