Structural and functional characterization of the protein-protein interaction between the HCMV immunoevasin UL16 and the NKG2D ligand MICB

Abstract

Antiviral cytotoxicity of lymphocytes such as natural killer (NK) cells, CD8 alpha-beta T cells and gamma-delta T cells is stimulated by the activating immunoreceptor NKG2D, which has the remarkable ability to engage at least eight highly diverse, stress-inducible MHC class I-related ligands (MICs and ULBPs) upregulated on the surface of virus-infected cells. In order to subvert an NKG2D-mediated antiviral immune response by cytotoxic lymphocytes, the human cytomegalovirus (HCMV) immunoevasin UL16 counteracts NKG2D-mediated immune responses by intracellular retention of the distantly related NKG2D ligands MICB, ULBP1, ULBP2 and ULBP6 (RAET1L). However, other highly related NKG2D ligands such as the MICB-homolog MICA, the ULBP2-homolog ULBP5 (RAET1G) and other ULBPs such as ULBP3 and ULBP4 are not targeted by UL16. The primary objectives of this work were (1) to elucidate the molecular basis for the promiscuous but highly selective binding of the HCMV immunoevasin UL16 to diverse NKG2D immunoreceptor ligands, (2) to obtain insights into the molecular adjustments of NKG2D ligands that escape UL16 engagement, and (3) to address the question whether selective pressure exerted by viral immunoevasins such as UL16 may have contributed to the diversification of NKG2D ligands. In order to achieve these goals, structural and functional analyses of the protein-protein interaction between UL16 and the NKG2D ligand MICB were performed using X-ray crystallography and surface plasmon resonance (SPR). The work presented in this thesis eventually led to the crystal structure determination of the HCMV immunoevasin UL16 in complex with the NKG2D immunoreceptor ligand MICB at 1.8 Å resolution. This is, to the best of the author’s knowledge, the first structure of a viral immunoevasin in complex with a stimulatory NK cell immunoreceptor ligand. Furthermore, the affinities and kinetics of various UL16–NKG2D-ligand interactions were determined by SPR. The structural analyses of the UL16-MICB complex shows that the heavily glycosylated UL16 protein folds into a V-type immunoglobulin-like domain. Contacts with MICB are mediated via a glycan-free three-stranded beta-sheet in the UL16 protein, which engages a region of MICB that substantially overlaps with the binding site for NKG2D. Surprisingly, the performed structural analyses also revealed that residues at the center of this beta-sheet mimic a central binding motif used by the structurally unrelated NKG2D immunoreceptor to bind diverse NKG2D ligands. It was also found that both MICA and ULBP3 have apparently evolved to escape recognition by UL16 through alteration of key residues at strategic locations. These results demonstrate that both humans and HCMV independently and likely through convergent evolution, evolved two structurally distinct receptors, NKG2D and UL16, that share the same central ligand binding motif in order to achieve promiscuous binding to MIC and ULBP molecules. This suggests that the selective pressure exerted by UL16 through structural mimicry of this central NKG2D-binding motif contributed to drive the diversification of NKG2D ligands and led to the emergence of non-UL16 binding NKG2D ligands such as MICA and ULBP3. Taken together this work provides new insights into the molecular basis of the immunological arms race between a persistent human pathogen (HCMV) and cellular surveillance systems (NK cells) of the human immune system, exemplified by the promiscuous binding mode of the HCMV immunoevasin UL16 and the diversification of NKG2D ligands.

Die antivirale Zytotoxizität von Lymphozyten wie beispielsweise Natürlicher Killerzellen, CD8 alpha-beta T Zellen und gamma-delta T-Zellen wird durch den aktivierenden Immunrezeptor NKG2D stimuliert. Dieser besitzt die besondere Fähigkeit acht, in ihrer Aminosäuresequenz z. T. sehr unterschiedliche, MHC Klasse I-ähnliche Liganden (MICs und ULBPs) zu binden, deren Oberflächenexpression durch zellulären Stress wie z. B. während einer viralen Infektion, verstärkt werden kann. Das humane Zytomegalovirus (HCMV) Immunevasin UL16 ist jedoch in der Lage eine NKG2D-vermittelte, antivirale Immunantwort zu verhindern, indem es die NKG2D Liganden MICB, ULBP1, ULBP2 und ULBP6 (RAET1L) gezielt im Inneren der Zelle zurückhält. Interessanterweise existieren aber auch NKG2D Liganden wie beispielsweise das zu MICB homologe MICA, das zu ULBP2 homologe ULBP5 (RAET1G) sowie ULBP3 und ULBP4, die nicht von UL16 erkannt und in der Zelle zurückgehalten werden. Die Hauptziele dieser Arbeit bestanden darin (1) die molekulare Basis für das promiskuitive und gleichzeitig hochselektive Bindeverhalten des HCMV Immunevasins UL16 an NKG2D Immunrezeptorliganden aufzuklären, (2) Erkentnisse über die molekularen Anpassungen derjenigen NKG2D Liganden zu gewinnen, die nicht von UL16 gebunden werden, und (3) die Frage zu erörtern ob selektiver Druck durch UL16 möglicherweise zur Diversifikation der NKG2D Liganden beigetragen hat. Um diese Ziele zu erreichen, wurden Struktur-Funktionsanalysen der Protein-Protein Interaktion zwischen UL16 und dem NKG2D Liganden MICB mittels Röntgenstrukturanalyse und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) durchgeführt. Die hier präsentierte Arbeit beschreibt den Weg zur Lösung der Kristallstruktur des HCMV Immunevasins UL16 im Komplex mit dem NKG2D Immunrezeptorliganden MICB. Die Auflösung der Struktur beträgt 1.8 Å und ist, nach bestem Wissen des Autors, die erste eines viralen Immunevasins im Komplex mit einem stimulierenden Liganden eines NK Rezeptors. Zudem wurden die Affinitäten und Kinetiken der verschiedenen UL16-NKG2D Ligandeninteraktionen mittels SPR bestimmt. Die strukturelle Analyse des UL16-MICB Komplexes zeigt, dass das stark glykosylierte UL16 Protein eine V-typ immunglobulinähnliche Faltung besitzt. Kontakte mit MICB werden durch ein glykanfreies beta-Faltblatt hergestellt, wobei die MICB Kontaktregion des UL16 Proteins deutlich mit der von NKG2D überlappt. Überraschenderweise zeigen die strukturellen Analysen zudem, dass Aminosäurereste im Zentrum des UL16 beta-Faltblatts ein zentrales Bindemotiv des NKG2D Immunrezeptors imitieren, welches letzterer nutzt, um seine hochdiversen Liganden zu binden. Zudem wurde gezeigt, dass die Substitution von Schlüsselaminosäuren an strategisch wichtigen Positionen sowohl MICA als auch ULBP3 erlauben einer UL16 Erkennung zu entgehen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl Mensch als auch das humane Zytomegalovirus unabhängig voneinander, und zwar vermutlich durch konvergente Evolution, zwei strukturell völlig unterschiedliche Rezeptoren, NKG2D und UL16, entwickelt haben, die das gleiche zentrale Bindemotiv besitzen, um die in ihrer Sequenz sehr unterschiedlichen MIC und ULBP Moleküle binden zu können. Die gezeigte strukturelle Nachahmung eines zentralen NKG2D Bindemotivs deutet zudem darauf hin, dass UL16 einen Beitrag zur Diversifikation der NKG2D Liganden geleistet und zur Entwicklung von nicht-UL16 bindenden Liganden wie MICA und ULBP3 beigetragen hat. Zusammengefasst liefert die vorliegende Arbeit am Beispiel des promiskuitiven Bindemodus des HCMV Immunevasins UL16 und der Diversifikation der NKG2D Liganden neue Einblicke in die molekulare Basis des immunologischen Wettlaufs zwischen einem persistierenden humanen Pathogen (HCMV) und zellulären Überwachungssystemen (NK Zellen) des menschlichen Immunsystems.