Untersuchungen zur zellulären Aufnahme von zellpenetrierenden Peptiden und der Bioaktivität von HPMA-Peptid-Konjugaten, sowie Charakterisierung eines neuen zellpenetrierenden Peptids aus humanem Lactoferrin

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dc.contributor.advisor Brock, Roland (Prof. Dr.) de_DE
dc.contributor.author Duchardt, Falk de_DE
dc.date.accessioned 2009-04-01 de_DE
dc.date.accessioned 2014-03-17T11:28:00Z
dc.date.available 2009-04-01 de_DE
dc.date.available 2014-03-17T11:28:00Z
dc.date.issued 2009 de_DE
dc.identifier.other 305032631 de_DE
dc.identifier.uri http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-37793 de_DE
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10900/43906
dc.description.abstract In dieser Arbeit wird ein neuer und sehr effektiver zellulärer Aufnahmemechanismus für zellpenetrierende Peptide (CPPs) beschrieben. Dieser Aufnahmemechanismus wird ab einer bestimmten Konzentration von extrazellulärem Peptid induziert und führt zu einer zytoplasmatischen Lokalisation der Peptide. Die Konzentration, um diese Aufnahme auszulösen, ist von den Eigenschaften des eingesetzten Peptids abhängig. Sowohl die Ladung als auch die Sekundärstruktur bilden dabei wichtige Parameter. Für R9 konnte gezeigt werden, dass ab einer Konzentration von 10 µM neben einer vesikulären auch eine starke zytoplasmatische Verteilung des Peptids vorliegt. Für das weniger kationische Peptid Penetratin dagegen sind wesentlich höhere Konzentrationen und Änderungen der Membranzusammensetzung notwendig, um den gleichen Effekt zu erreichen. Eine genaue Beobachtung der Aufnahmekinetik von R9 ergab, dass die Aufnahme innerhalb von Minuten stattfindet und mit einer starken Membranaktivität einhergeht. Membranbereiche, in denen die Aufnahme stattfand, wurden als Nucleation Zones bezeichnet. Die elektronenmikroskopische Analyse dieser Zonen ergab keine morphologischen Besonderheiten im Vergleich zwischen Nucleation Zones und anderen Bereichen. Bei der Peptidaufnahme über Nucleation Zones spielen Heparansulfat-Proteoglykane (HSPG) als zelluläre Oberflächenmoleküle eine wichtige Rolle. Der Verlust von HSPG kann die Ausbildung von Nucleation Zones verhindern. Auch der Einsatz von Rottlerin, einem Protein Kinase C-Inhibitor, kann die Ausbildung von Nucleation Zones inhibieren. Sowohl die Schnelligkeit des Imports als auch die Abwesenheit von Vesikeln machen die Einordnung des Aufnahmewegs in einen der etablierten Endozytosewege schwer. Während der effektiven Peptidaufnahme bleibt die Membranintegrität gewahrt und die Ausbildung von Nucleation Zones hat keine zytotoxischen Folgen. Dieser hocheffektive, nichttoxische Aufnahmemechanismus kann die Grundlage für die Entwicklung neuer peptidbasierter Transfektionsstrategien bilden. Weiterhin wurde ein neues zellpenetrierendes Peptid aus humanem Lactoferrin vorgestellt und charakterisiert (hLF-Peptid). Die zelluläre Aufnahme des hLF-Peptids zeigte schon bekannte Charakteristiken der CPP-Internalisierung bezüglich Effektivität, Lokalisation und Kinetik. Bemerkenswert ist, dass das hLF-Peptid trotz weniger Arginine in dem gleichen Konzentrationsbereich wie R9 über Nucleation Zones in die Zellen aufgenommen wird. Hier spielt die Sekundärstruktur des Peptids eine entscheidende Rolle. Denn nur das über eine Disulfidbrücke zyklisierte Peptid wird effektiv von den Zellen aufgenommen. Außerdem ist das Peptid in der Lage, unterschiedliche Cargos effektiv in Zellen zu transportieren. Die hohe Aktivität des hLF-Peptids verbunden mit seiner humanen Herkunft und der damit verbundenen Unbedenklichkeit machen hLF zu einem hochinteressanten Vektormolekül für die biomedizinische Forschung nicht nur für den Einsatz in vitro, sondern vor allem in vivo. In einem weiteren Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kopplung von Peptiden an das N-(2-(Hydroxypropyl)methacrylamid Copolymer (HPMA) eine erfolgsversprechende Strategie ist, die Bioaktivität von Peptiden zu erhöhen. Außerdem wurde die Möglichkeit einer Kombination von zwei bioaktiven Peptiden aufgezeigt. Das apoptose-induzierende BIDBH3-Peptid und das CPP R9 wurden zusammen mit nativer chemischer Ligation auf HPMA gekoppelt und führten zu einer effektiven Aufnahme des Konstrukts bei erhöhter Aktivität des BIDBH3-Peptids. Die Möglichkeiten einer polymerunterstüzten Applikation von Wirkstoffen sind enorm und könnten durch die Kombination von gewebespezifischen Vektoren mit hochwirksame Therapeutika eine effektive und schonende Behandlung bedeuten. de_DE
dc.description.abstract This work describes a new and very effective cellular uptake mechanism for cell-penetrating peptides (CPP). This uptake mechanism is induced once the peptide reaches a certain extracellular concentration and leads to a cytoplasmic distribution of the peptide. The concentration which is necessary to induce this uptake is dependent on the characteristics of the peptide. Hence, peptide charge as well as peptide secondary structure are important parameters. For R9 it could be shown that a concentration of 10 µM leads to a vesicular and a cytoplasmic peptide distribution within cells. For less positively charged peptides, e.g. Penetratin, a far higher peptide concentration and interference with the composition of the membrane are necessary to achieve the same effect. Precise observation of the R9 uptake kinetics showed that the uptake takes place within minutes and is accompanied by a strong membrane activity. We called the affected membrane areas nucleation zones. Analysis of nucleation zones by electron microscopy revealed no morphological differences between areas with and without nucleation zone. For peptide uptake via Nucleation Zones heparansulfate-proteoglycans (HSPG) play a major role as cellular surface structures. Loss of HSPG inhibits the development of nucleation zones. Also the protein kinase C inhibitor rottlerin prevents the development of nucleation zones. Due to the speed of import and the absence of vesicles it is difficult to attribute the uptake to one of the established endocytotic pathways. No loss of membrane-integrity occurs and no cytotoxic effekt could be detected during the effective peptide uptake. Thus, this highly efficient and nontoxic way of uptake could be the basis e.g. for the development of new peptide based transfection-strategies. Furthermore a new CPP derived from human lactoferrin was indentified and characterised (hLF). The cellular uptake of hLF showed the well known characteristics of CPP internalisation concerning efficacy, localisation and kinetics. Remarkably, although less arginines are present in the sequence, the hLF peptide is taken up via nucleation zones in the same concentration range as R9. This is based on the secondary structure of hLF. Only the disulfide bond-based cyclic form of the hLF-peptide is taken up efficiently by the cells. Furthermore the peptide is able to efficiently transport different cargos into cells. The high efficacy combined with the harmlessness of a human-derived peptide show that the peptide is a highly interesting vector for biomedical research, not only in vitro, but especially in vivo. In a third part of this work it was shown that coupling of peptides to a N-(2-(Hydroxypropyl)methacrylamid copolymer (HPMA) is a promising strategy to increase the bioactivity of peptides. Moreover the activity of a construct was shown that combined two different peptides on one polymer. This construct consisted of the apoptosis-inducing BIDBH3 peptide and the CPP R9. These two functionalities were coupled on HPMA by native chemical ligation and showed an efficient cellular uptake and increased activity of the BIDBH3 peptide. The possibilities of a polymer-based application of agents are enormous and could lead to an effective and well tolerated treatment by combining tissue-specific vectors with highly efficient therapeutics. en
dc.language.iso de de_DE
dc.publisher Universität Tübingen de_DE
dc.rights ubt-podok de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en en
dc.subject.classification Endocytose , Lactoferrin de_DE
dc.subject.ddc 570 de_DE
dc.subject.other Zellpenetrierende Peptide , HPMA , R9 de_DE
dc.subject.other Endocytosis , Lactoferrin , Cell penetrating peptides , HPMA, R9 en
dc.title Untersuchungen zur zellulären Aufnahme von zellpenetrierenden Peptiden und der Bioaktivität von HPMA-Peptid-Konjugaten, sowie Charakterisierung eines neuen zellpenetrierenden Peptids aus humanem Lactoferrin de_DE
dc.title Analysing the cellular uptake of cell penetrating peptides and the bioactivity of HPMA-peptide conjugates, as well as characterisation of a new cell penetrating peptide derived from human lactoferrin en
dc.type Dissertation de_DE
dcterms.dateAccepted 2009-03-16 de_DE
utue.publikation.fachbereich Interfakultäres Institut für Zellbiologie (IFIZ) de_DE
utue.publikation.fakultaet 8 Zentrale, interfakultäre und fakultätsübergreifende Einrichtungen de_DE
dcterms.DCMIType Text de_DE
utue.publikation.typ doctoralThesis de_DE
utue.opus.id 3779 de_DE
thesis.grantor 15 Fakultät für Biologie de_DE

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